doktorska disertacija
Tine Tesovnik (Author), Tadej Battelino (Mentor), Katarina Trebušak Podkrajšek (Co-mentor)

Abstract

UVOD Sladkorna bolezen tipa 1 nastane kot posledica avtoimunskega uničenja celic beta Langerhansovih otočkov trebušne slinavke, ki izločajo glavni anabolni hormon inzulin. Zaradi pomanjkanja lastnega hormona inzulina so osebe s sladkorno boleznijo tipa 1 primorane doživljenjsko prejemati zdravljenje z dodajanjem eksogenih odmerkov inzulina in dosledno izvajati meritve krvnega sladkorja, s čemer lahko preprečijo oziroma odložijo nastanek zapletov sladkorne bolezni. Vzrok nastanka avtoimunosti še vedno ni pojasnjen, med drugim tudi zaradi pomanjkanja bioloških označevalcev za zgodnje odkrivanje bolezni in zaradi tkivne nedostopnosti celic beta Langerhansovih otočkov v človeškem organizmu. Zunajcelični vezikli so majhne sferične strukture, ki jih celice izločajo v zunajcelični prostor z namenom celične komunikacije in usklajenega delovanja organizma. Poleg vloge pri zagotavljanju normalnega delovanja organizma lahko zunajcelični vezikli in miRNA sodelujejo tudi pri patogenezi številnih bolezni. Z doktorskim delom smo poskušali opredeliti zunajcelične vezikle kot potencialne biološke označevalce in posrednike pri nastanku sladkorne bolezni tipa 1. METODE Prisotnost zunajceličnih veziklov v izolirani frakciji krvne plazme z verjetnim izvorom iz celic beta Langerhansovih otočkov smo dokazovali z označevanjem vzorcev s specifičnimi protitelesi in slikanjem s transmisijsko elektronsko mikroskopijo. Z metodo sekvenciranja naslednje generacije smo določali miRNA zunajceličnih veziklov izoliranih iz krvne plazme desetih posameznikov s sladkorno boleznijo tipa 1 ob izbruhu bolezni, desetih posameznikov z več kot deset let trajajočo boleznijo in desetih zdravih preiskovancev. Z namenom opredelitve miRNA zunajceličnih veziklov, ki so prisotni v krvni plazmi ob intenzivnem propadu celic beta, smo kronološko analizirali tudi vzorce zunajceličnih veziklov izoliranih iz krvne plazme dveh transplantirancev Langerhansovih otočkov. Vpliv izbranih različno izraženih miRNA smo določali z in vitro testiranjem na vzorcih polne krvi, pri čemer smo spremljali izražanje označevalca zgodnje aktivacije CD69 in citotoksičnosti CD107a celic imunskega sistema s pretočno citometrijo. S fluorescenčno označeno miRNA smo s pretočno citometrijo in fluorescenčno mikroskopijo opredeljevali kopičenje veziklov v krvnih celicah imunskega sistema. Aktivacijo krvnih celic imunskega sistema ob izpostavitvi z miRNA s sintetičnimi vezikli smo utišali z dodatkom inhibitorja endosomalnih TLR7/8 receptorjev in predpostavili potencialen model učinkovanja miRNA zunajceličnih veziklov na imunski sistem. Pri preiskovancih s sladkorno boleznijo tipa 1 smo dodatno opredelili tudi dolžine telomer, ki so tudi uravnavane z miRNA in veljajo za označevalce staranja organizma ter delovanja oksidativnega stresa. REZULTATI S transmisijsko elektronsko mikroskopijo smo dokazali prisotnost zunajceličnih veziklov v krvni plazmi, ki potencialno izvirajo iz celic beta Langerhansovih otočkov, kar nakazuje na možno komunikacijo celic beta z drugimi tkivi v človeškem telesu. S sekvenciranjem naslednje generacije smo določili različno izražene miRNA pri preiskovancih s sladkorno boleznijo tipa 1 in intenzivnemu propadu celic beta ob transplantaciji Langerhansovih otočkov. Na podlagi rezultatov primerjalnih analiz izražanja miRNA smo izbrali osem zvrsti miRNA (hsa-miR-122-5p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-193b-5p, hsa-miR-185-5p, hsa-miR-195-3p, hsa-miR-455-5p, hsa-miR-375-3p, hsa-miR-129-5p), ki smo jih s sintetičnimi vezikli izpostavili nativnim krvnim celicam oseb s sladkorno boleznijo tipa 1 in zdravih preiskovancev pri in vitro pogojih, kar je povzročilo aktivizacijo celic imunskega sistema. Aktivacija imunskega sistema se je odražala s povečanim izražanjem zgodnjega označevalca aktivacije CD69 in citotoksičnosti CD107a celic T CD4+ in CD8+ in naravnih celic ubijalk CD56+. Pokazali smo, da se vezikli preferenčno kopičijo v fagocitnih krvnih celicah, kjer se nahajajo TLR7 in TLR8 receptorji, ki so najverjetneje odgovorni za prepoznavanje vezikularnih miRNA. Vpletenost TLR7 in TLR8 smo dokazovali s TLR7/8 inhibitorjem klorokinom, ki je ob stimulaciji celic imunskega sistema z miRNA in sintetičnimi vezikli znižal aktivacijski odziv. Prepoznavanje človeških miRNA zunajceličnih veziklov v endosomalni poti fagocitnih celic s TLR7 in TLR8 sproži imunski odziv in aktivacijo efektorskih celic imunskega sistema. Rezultati naših raziskav so pokazali tudi razlike v izražanju miRNA, katerih vloga je že bila vpisana pri regulaciji dolžin telomer. Dolžine telomer pri preiskovancih s sladkorno boleznijo tipa 1 s slabo glikemično urejenostjo so se krajšale hitreje kot pri preiskovancih z dobro glikemično urejenostjo, k čemur so morda pripomogle tudi miRNA zunajceličnih veziklov. ZAKLJUČEK Rezultati naše raziskave nakazujejo na pomembno vlogo človeških miRNA pri regulaciji imunskega sistema in staranja organizma. miRNA zunajceličnih veziklov so lahko udeležene pri aktivaciji imunskega sistema in lahko pripomorejo k nastanku začetnega vnetja Langerhansovih otočkov. Človeške miRNA tako lahko sodelujejo pri razvoju avtoimunosti in nastanku sladkorne bolezni tipa 1. Raziskava dodatno razkriva potencialne tarče za preprečevanje in zdravljenje sladkorne bolezni tipa 1.

Keywords

endokrinologija;biokemija;

Data

Language: Slovenian
Year of publishing:
Typology: 2.08 - Doctoral Dissertation
Organization: UL MF - Faculty of Medicine
Publisher: [T. Tesovnik]
UDC: 616.379(043.3)
COBISS: 22023939 Link will open in a new window
Views: 1065
Downloads: 301
Average score: 0 (0 votes)
Metadata: JSON JSON-RDF JSON-LD TURTLE N-TRIPLES XML RDFA MICRODATA DC-XML DC-RDF RDF

Other data

Secondary language: English
Secondary title: Extracellular vesicles derived small non-coding RNA in type 1 diabetes
Secondary abstract: INTRODUCTION Type 1 diabetes is caused by autoimmune destruction of Langerhans islets' beta-cells, resulting in an absolute lack of one’s own insulin. Hence, individuals with type 1 diabetes require a life long intensive exogenous insulin therapy with glucose monitoring to prevent the development of diabetes-related complications, which can dramatically shorten their lifespan. The cause of type 1 diabetes is still unknown due to a lack of biomarkers and difficulties in gaining the insight into beta-cells functioning during the developmental stages of the disease. With their molecular cargo extracellular vesicles can modulate a target cell response and may affect the pathogenesis of the diseases. The extracellular vesicles containing miRNAs are often studied as disease biomarkers, but rarely as mediators of development of the disease. The role of extracellular vesicles derived miRNAs in type 1 diabetes is currently not well established. Our work aimed to evaluate the extracellular vesicles as biomarkers in type 1 diabetes and evaluate their role in the modulation of the immune system in the development of the disease. METHODS Transmission electron microscopy and vesicle labelling with specific antibodies was used to characterize the extracellular vesicles originating from insulin-producing pancreatic beta cells in blood plasma. In the next step, differentially expressed extracellular vesicles’ miRNAs were evaluated using the next-generation sequencing approach in ten individuals with type 1 diabetes at the disease onset, ten individuals with ten years duration of the disease, and ten healthy controls. To assess the extracellular vesicle miRNAs in intensive beta-cell destruction, Langerhans islet transplantation individuals’ chronological blood plasma samples were sequenced and analysed. Eight differentially expressed miRNAs in type 1 diabetes and Langerhans islets destruction were selected for the in vitro immunomodulation testing with the synthetic vesicle delivery system on the whole blood samples. Flow cytometry was applied to evaluate the immune system activation with the detection of CD107a degranulation and CD69 early activation markers on CD4+ and CD8+ T-cells and CD56+ NK cells. The vesicle miRNA accumulation in the cells of the immune system was evaluated with microscopy and flow cytometry after the whole blood cells exposure to synthetic vesicles and fluorescent labeled miRNA. The endosomal TLR7/8 inhibition in the transfection experiments was performed to evaluate the role of these receptors in the recognition of extracellular vesicle delivered miRNA in the immune system activation. Additionally, miRNAs regulate telomere lengths in the cells of a human organism and these are biomarkers of oxidative stress and organsim aging. Telomere lengths were assessed in the individuals with type 1 diabetes according to their glycemic control. RESULTS Transmission electron microscopy imaging confirmed Langerhans islets beta-cell-released extracellular vesicles in the blood plasma and potential beta-cells’ communication with other tissues. Based on the next-generation sequencing differential expression analysis results, eight significantly differentially expressed miRNA in type 1 diabetes and Langerhans transplantation individuals were selected (hsa-miR-122-5p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-193b-5p, hsa-miR-185-5p, hsa-miR-195-3p, hsa-miR-455-5p, hsa-miR-375-3p and hsa-miR-129-5p). The selected differentially expressed miRNA delivered with synthetic vesicles to the whole blood samples from participants with type 1 diabetes and healthy controls showed the immunomodulation activity with the overexpression of an early activation marker CD69 and a cytotoxicity marker CD107a on CD4+ and CD8+ T-cells and CD 56+ NK cells. The phagocytic cells accumulated vesicles with miRNAs in the endolysosomal pathway, where TLR7 and TLR8 were expressed. The potential involvement of the endolysosomal TLR7/8 in the activation of the immune system was shown with the endosomal TLR7/8 inhibitor chloroquine, which effectively inhibited a vesicle delivered miRNAs activation. The sequencing results also revealed differentially expressed miRNAs, whose role was reported in the telomere length regulation. The telomere length erosion in the individuals with type 1 diabetes with poor glyceamic control was accelerated compared to the good glycemic controlled individuals. SUMMARY Our results illustrate miRNAs derived from human blood plasma extracellular vesicles as modulators of the immune system in type 1 diabetes autoimmunity, providing a potentially new insight into the pathogenesis of the disease, and novel molecular targets for intervention and type 1 diabetes prevention.
Secondary keywords: Diabetes mellitus, type 1;Genetics;Etiology;Therapy;Complications;Pancreas;Insulin;Oxidative stress;Cell communication;Extracellular vesicles;Isolation and purification;RNA, small untranslated;In vitro techniques;Sladkorna bolezen, tip 1;Genetika;Etiologija;Terapija;Komplikacije;Trebušna slinavka;Inzulin;Oksidativni stres;Celična komunikacija;Zunajcelični vezikli;Izolacija in čiščenje;Mala neprevedena RNA;In vitro tehnike;
Type (COBISS): Dissertation
Study programme: 0
Embargo end date (OpenAIRE): 1970-01-01
Thesis comment: Univ. v Ljubljani, Medicinska fak.
Pages: V, 115 str.
ID: 11498024