Secondary abstract: |
V pričujoči disertaciji smo proučili vpliv meddelčnih interakcij na fazno stabilnost nekaterih globularnih proteinov, s poudarkom na kokošjem lizocimu iz jajčnega beljaka (jajčni lizocim). Raziskavo smo izvedli v okviru prepleta raznolikih eksperimentalnih tehnik, teoretičnega pristopa in računalniških simulacij molekulske dinamike. Delo je razdeljeno na štiri dele: Fazna stabilnost in kristalizacija jajčnega lizocima, fibrilizacija jajčnega lizocima, ekspresija in proučevanje različic lizocima T4 ter simulacije vodnih raztopin globularnih proteinov z molekulsko dinamiko.
Sprva smo na kratko, z uporabo različnih kristalizacijskih pristopov, raziskali kristalizacijo jajčnega lizocima pri različnih pogojih v raztopini. Rezultati so pokazali, da fazna separacija kapljevina-kapljevina (LLPS) spodbudi kristalizacijo jajčnega lizocima in pridela več kristalov zmanjšo prisotnostjo nečistoč kot pri konvencionalnem izhlapevanju topila. Za nečistoče, ki so prisotne v kupljenem jajčnem lizocimu je bilo prikazano, da imajo zanemarljiv vpliv na fazno stabilnost njegovih raztopin. Nadaljevali smo s proučevanjem fazne stabilnosti 10 različnih pufrskih raztopin jajčnega lizocima. Ugotovili smo, da je fazna stabilnost pufrskih raztopin jajčnega lizocima močno odvisna od pogojev v raztopini in prav tako od izbire pufra. Rezultati fazne stabilnosti jajčnega lizocima v številnih pufrih pri pH=7,0 so nedvomno pokazali na prisotnost pufer specifičnih efektov. Z uporabo preprostega modela v okviru Wertheimove perturbacijske teorije smo lahko napovedali koeksistenčne krivulje jajčnega lizocima v številnih pufrih pri pH=7,0, ki so se dobro ujemale z našimi lastnimi meritvami temperature zmotnitve (Tzmotnitve) teh raztopin. Poleg tega, smo z uporabo tega modela ovrednotili vpliv pufrov pri pH=7,0 na interakcije med proteini, kakor tudi na parametre modela. Naše ugotovitve predpostavljajo kompeticijo med anioni pufra in soli za vezavo na pozitivno nabito površino jajčnega lizocima. Z merjenjem dinamičnega sipanja svetlobe (DLS) pufrskih raztopin jajčnega lizocima, smo določili drugi virialni koeficient in interakcijski difuzijski koeficient (B22 in kD), ki sta nam podala informacije o dejanskih medproteinskih interakcijah v proučevanih raztopinah jajčnega lizocima. Za tako B22 kot kD je bilo prikazano, da sta v smiselni korelaciji z izmerjenimi vrednostmi Tzmotnitve.
V drugem delu smo proučili, kako različni pogoji v raztopini vplivajo na fibrilizacijo jajčnega lizocima. Nastanek amiloidnih fibril jajčnega lizocima smo zaznali z uporabo visoko amiloidofilnih barvil tioflavina T (ThT) in Conga rdeče (CR). Jajčni lizocim je fibriliziral zgolj pod vzbujenimi pogoji pri pH=2,0, kjer so pogoji omogočali delno razvitje proteina in hkrati omogočili, da je proces uspel premostiti elektrostatsko odbojno bariero zaradi visoko pozitivno nabitih molekul jajčnega lizocima. Omenjeni pogoji so bili izpolnjeni zgolj v 0,5 M glicinskem pufru ter v KCl-HCl pufru z 0,25 in 0,5 M ionsko jakostjo. Pri enako ugodnih pogojih pa fibrile jajčnega lizocima niso bile opažene v fosfatnem pufru, kar nakazuje na pufer specifične efekte. Tudi za nekatere dodatne pufre je bila ugotovljena stabilizirajoča vloga, saj so prav tako preprečili fibrilizacijo jajčnega lizocima. Ugotovljeno je bilo, da senčenje elektrostatskih odbojev igra pomembno, a ne ključno vlogo pri procesu fibrilizacije. Z dodatkom zadostne količine inertnega polimera, PEG12000, smo uspeli preprečiti fibrilizacijo jajčnega lizocima v predhodno visoko amiloidogeni raztopini.
V tretjem delu te disertacije smo izvedli ekspresijo psevdo-divjega tipa (WT*) lizocima T4 in njegove točkovne mutante L99I*. Ekspresijo proteinov smo optimizirali do te mere, da smo pridobili do 100 mg obeh proteinov iz 3,2 L medija za gojenje. Posneti spektri cirkularnega dikroizma (CD) obeh proteinov so pokazali, da nadomestitev levcina z izolevcinom nima pomenljivega vpliva na sestavo sekundarne strukture glede na lizocim T4 WT*. Poleg tega sta obe različici lizocima T4 prikazali skoraj 30 % višjo vsebnost α-vijačnic kot jajčni lizocim pri identičnih pogojih v raztopini. Meritve fazne stabilnostilizocima T4 WT* so dokazale, da je lizocim T4 WT* manj dovzeten za fazno separacijo kot jajčni lizocim, saj fazna separacija, navkljub ohlajanju lizocima T4 WT* pri enakih pogojih v raztopini vse do -6°C, ni bila dosežena. Tako CD spektroskopija kot diferenčna dinamična kalorimetrija (DSC) sta pokazali, da je lizocim T4 WT* konformacijsko bolj stabilen od lizocima T4 L99I*, saj se je slednji razvil pri ≈4,3°C nižji temperaturi.
Na koncu predstavimo še izvedbo številnih atomističnih simulacij vodnih raztopin jajčnega lizocima, lizocima T4 WT* in γ-D kristalina z uporabo molekulske dinamike. Izračunane fluktuacije v gostoti so pokazale jasno razvidne, s proteini obogatene in s proteini osiromašene regije, za vse raztopine z visoko vsebnostjo proteinov. Narava samozdruževanja proteinov je bila delno reverzibilna, kar je bilo še posebej izraženo v raztopinah, ki so bile blizu eksperimentalnim pogojem fazne separacije. Omenjeno samozdruževanje proteinov se je odrazilo v njihovih difuzijskih koeficientih, ki so se znižali z rastočo koncentracijo proteinov in njihovo molekulsko maso, kakor tudi s padajočo temperaturo. Hidratacijo proteinov smo ocenili z izračunom parskih porazdelitvenih funkcij za center mase kisikovega atoma vode in proteina, kakor tudi s topilu dostopno površino (SASA). Rezultati slednje so pokazali, da je vodi dostopna površina odvisna ne le od obsega samozdruževanja, pač pa tudi odstopnje reverzibilnosti tega procesa. Spremljali smo tudi časovno odvisnost radija giracije in dokazali,da so navkljub tvorbi proteinskih klastrov vsi proteini ostali v svojem kompaktnem (nativnem) stanju. Izračunane parske porazdelitvene funkcije za medproteinske centre mas (COM) so pokazale številne vrhove interakcij, ki ustrezajo najbolj pogostim kontaktom med proteini. Celovita analiza kontaktov aminokislina-aminokislina med vsemi pari proteinov nam je omogočila določitev najbolj pomembnih parov aminokislina–aminokislina, kakor tudi posameznih aminokislin, odgovornih zatvorbo začetnih kontaktov. V raztopinah tako jajčnega lizocima kot γ-D kristalina je bil arginin prevladujoči aminokislinski ostanek v tako sprožitvi prvih kontaktov, kakor tudi v celokupni tvorbi parov aminokislin, pri čemer so bili njegovi partnerji večinoma ostanki, ki so sposobni tvoriti solne mostičke in vodikove vezi. V raztopinah lizocima T4 WT* pa je naziv prevladujoče aminokisline pripadel lizinu, ki je bil najpogosteje opažen v paru z nasprotno nabito asparaginsko kislino |