magistrsko delo
Nik Franko (Avtor), Roman Jerala (Mentor), Roman Jerala (Član komisije za zagovor), Branka Javornik (Član komisije za zagovor), Mojca Narat (Član komisije za zagovor)

Povzetek

Terapevtske aplikacije sintezne biologije prinašajo rešitve v zdravljenju najrazličnejših bolezni z inovativnimi pristopi. Končni produkt slednjih so tako imenovana živa zdravila, ki so se v odvisnosti od zunanjega signala sposobna odzvati s sintezo efektorske molekule oziroma zdravilne učinkovine. Živa zdravila so kompleksni biološki sistemi, ki morajo biti natančno kontrolirani. Za kontrolo se uporabljajo sintezno-biološka orodja, ki v večini primerov temeljijo na regulaciji prepisovanja genov. Slabost slednje predstavlja počasen odziv na vhodni signal kar v določenih terapevtskih aplikacijah predstavlja problem. V magistrski nalogi smo pripravili in testirali inovativen sistem za hitro izločanje proteinov iz celic, kontroliran na post-translacijskem nivoju preko proteolize. S posnemanjem mehanizma za zadrževanje proteinov v lumnu oziroma na membrani endoplazmatskega retikuluma, smo z dodatkom zadrževalnega zaporedja na poročevalski protein preprečili izločanje slednjega iz celic kar smo eksperimentalno pokazali s konfokalno mikroskopijo in prenosom Western. Razcepljeno proteazo TEVp, gensko povezano na kemijsko inducibilne dimerizacijske domene smo kontrolirali z dodatkom majhne molekule in uporabili za inducibilno cepitev zadrževalnega zaporedja. Rekonstituirana proteaza TEVp je odcepila zadrževalno zaporedje iz poročevalskega proteina v lumnu ali na membrani endoplazmatskega retikuluma in omogočila izločanje poročevalskega proteina SEAP katerega aktivnost smo izmerili v gojišču celic. S pripravljenimi sistemi kontroliranimi na post-translacijskem nivoju smo dosegli hitrejše izločanje poročevalskega proteina iz celic kot v primeru regulacije transkripcije. Za najhitrejšega se je izkazal sistem z zadrževanjem poročevalskega proteina v lumnu endoplazmatskega retikuluma in rekonstitucijo erTEVp, katere aktivnost v razcepljeni obliki smo kot prvi pokazali prav na primeru inducibilnega izločanja proteinov.

Ključne besede

sesalske celice;terapevtske aplikacije;sintezna biologija;kontrola bioloških sistemov;hitro izločanje proteinov;

Podatki

Jezik: Slovenski jezik
Leto izida:
Tipologija: 2.09 - Magistrsko delo
Organizacija: KI - Kemijski inštitut
Založnik: [N. Franko]
UDK: 606:61:577.2(043.2)
COBISS: 8833913 Povezava se bo odprla v novem oknu
Št. ogledov: 954
Št. prenosov: 598
Ocena: 0 (0 glasov)
Metapodatki: JSON JSON-RDF JSON-LD TURTLE N-TRIPLES XML RDFA MICRODATA DC-XML DC-RDF RDF

Ostali podatki

Sekundarni jezik: Angleški jezik
Sekundarni naslov: Inducible system for rapid protein release from mammalian cells
Sekundarni povzetek: Therapeutic applications of synthetic biology are providing new treatments for various diseases using innovative principles. These are termed living drugs that can sense a specific input signal and respond to it with synthesis of an effector molecule or drug. Living drugs are complex biological systems that must be tightly controlled. Control over biological systems is achieved with synthetic biology tools that are mostly focused on regulation of gene expression. The most important drawback of this type of regulation is a delay in signal transduction from input to output which is very important in some applications where fast response is required. In thesis we decided to prepare and test a new and innovative system for rapid protein release from post-translationaly controlled cells with proteolysis. Through mimicking natural mechanisms for protein retention in the lumen or at membrane of the endoplasmic reticulum (ER) we delayed protein release by fusion with the ER retention sequence. This was demonstrated by confocal microscopy and Western transfer. Split protease TEVp geneticaly fused to chemically induced dimerization domains was controlled by the addition of a small molecule and used for cleavage off of the ER retention sequence. After reconstitution of the split TEVp protease, retention sequence was cleaved off the protein that resided in the lumen or at the ER membrane causing release of the reporter protein SEAP from cells. SEAP activity was experimentaly determined in cells medium. With all designed systems controlled at the post-translational level, faster release of the protein was achived in comparison to transcriptionally controlled cells. The fastest protein release was achived in the system comprising protein retention in the lumen of the ER and reconstitution of split protease erTEVp whose activity in split form was showed for the first time in the system for the rapid protein release.
Sekundarne ključne besede: mammalian cells;therapeutic applications;synthetic biology;controlling biological systems;rapid protein release;
Vrsta dela (COBISS): Magistrsko delo/naloga
Študijski program: 0
Komentar na gradivo: Univ. v Ljubljani, Biotehniška fak., Študij biotehnologije
Strani: XIV, 70 f., [6] f. pril.
ID: 10910933