enoviti magistrski študij farmacije
Marjeta Jerman (Avtor), Tomaž Bratkovič (Mentor), Peter Molek (Komentor)

Povzetek

Nabor substanc za povečanje vzdržljivosti športnikov se nenehno povečuje, zato jim razvoj detekcijskih metod le stežka sledi. Ena izmed ovir obstoječih metod je visoka specifičnost, ki omogoča detekcijo že znane spojine, ne pa njihovih analogov ali mimetikov. Posledično je razvoj takšnih metod zamuden, njihova uporaba pri vsakodnevnih protidopinških aktivnostih pa draga. Raznolikost sodobnih substanc za povečanje vzdržljivosti športnikov zahteva razvoj naprednih bioanaliznih metod z uporabo znanja s področja biotehnologije in molekularne medicine. Namen magistrske naloge je načrtovanje in priprava ustrezne detekcijske sonde za določanje agonistov receptorja za eritropoetin v bioloških vzorcih. V ta namen smo na bakteriofagih delcih predstavili krajše peptidne ligande eritropoetinskega receptorja. Genski konstrukt za peptidni mimetik eritropoetina (EMP1) smo vnesli v bakteriofagni vektor M13KBE. Pripojili smo ga genu za kapsidni protein p3 in s tem omogočili njegovo predstavitev na površini bakteriofaga v fuziji s proteinom p3. Z izbranim vektorjem smo dosegli pentavalentno predstavitev peptida. Dodatno smo s podobnim pristopom kloniranja in uporabo vektorja pIT2 na površini bakteriofaga v monovalentni obliki izrazili posamezne peptidne ligande eritropoetinskega receptorja (EMP1, EMP5 in AF11154), prav tako v fuziji s proteinom p3. Z encimsko imunskimi testi (ELISA) smo potrdili vezavo fagnih delcev na rekombinantno zunajcelično domeno eritropoetinskega receptorja (EpoR), pri čemer je najnižjo afiniteto pričakovano izkazoval peptidni ligand AF11154. Pripravljene bakteriofagne delce smo kot detekcijske sonde preizkusili tako, da smo na dno vdolbinic mikrotitrske ploščice imobilizirali EpoR ter v vdolbinice sočasno nanesli bakteriofage s predstavljenim peptidom in vzorec s krajšim peptidnim agonistom oz. rekombinantnim eritropoetinom (rhEPO), zatem pa spremljali kompeticijo za vezavo na imobiliziran EpoR. Prisoten rhEPO oz. agonist je pričakovano najučinkovitejše zaviral vezavo na receptor bakteriofagov, ki imajo na svoji površini predstavljen peptid AF11154. S kompetitivnim testom ELISA smo tudi ocenili območje sorazmernega zmanjšanja vezave bakteriofagov v odvisnosti od koncentracije prisotnega rhEPO v vzorcu, ki pa je višja, kot so fiziološke koncentracije rhEPO.

Ključne besede

bioanalizne metode;agonisti eritropoetinskega receptorja;peptidni ligandi;predstavitev na bakteriofagu;

Podatki

Jezik: Slovenski jezik
Leto izida:
Tipologija: 2.09 - Magistrsko delo
Organizacija: UL FFA - Fakulteta za farmacijo
Založnik: [M. Jerman]
UDK: 796.011.5:178.8:61(043.3)
COBISS: 4481393 Povezava se bo odprla v novem oknu
Št. ogledov: 1166
Št. prenosov: 659
Ocena: 0 (0 glasov)
Metapodatki: JSON JSON-RDF JSON-LD TURTLE N-TRIPLES XML RDFA MICRODATA DC-XML DC-RDF RDF

Ostali podatki

Sekundarni jezik: Angleški jezik
Sekundarni naslov: Display of erythropoietin receptor peptide ligands on filamentous
Sekundarni povzetek: The range of banned performance enhancing drugs in sports is rapidly expanding and development of detection methods does not keep up the pace with their demand. One of the drawbacks of the existing antidoping methods is the high specificity, which enables detection of common agents but not their analogs or mimetics. Consequently, the development of analytical methods is time consuming and their daily use in doping detections is expensive. The diversity of abused drugs requires the use of advanced bioanalytical procedures from the fields of biotechnology and molecular medicine. The aim of this master thesis is to design and construct probes for detection of erythropoietin receptor agonists in biological samples. For this purpose, short peptide ligands of erythropoietin receptor have been displayed on phage. The gene encoding peptide erythropoietin mimetic EMP1 was subcloned into M13KBE phage display vector. Foreign peptide was fused to the minor capsid protein p3 and displayed on all five copies on the tip of the phage. Similarly, we displayed three erythropoietin mimetic peptides (EMP1, EMP5 and AF11154) on phage in a monovalent seting using the pIT2 phagemid vector. Using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) we confirmed phage binding to recombinant erythropoietin receptor ectodomain (EpoR), where, as expected, AF11154 ligand showed the lowest affinity. Recombinant phages were assessed as detections probes by concurrent incubation with a synthetic agonist or recombinant erythropoietin (rhEPO) and monitoring competive binding to immobilized EpoR. The rhEPO and synthetic agonist most effectively inhibited the binding of phages with displayed AF11154 to the receptor. By using competitive ELISA assay, we estimated the range of proportional reduction in binding of bacteriophages as a function of rhEPO concentration in the sample. This range showed to be higher than physiological concentrations of rhEPO.
Sekundarne ključne besede: Doping;
Vrsta dela (COBISS): Magistrsko delo/naloga
Komentar na gradivo: Univ. Ljubljana, Fak. za farmacijo
Strani: X, 73 f.
ID: 10918194