Karakterizacija regulacije modula toksin-antitoksin higBA2 iz bakterije Vibrio cholerae in vivo

magistrsko delo

Iva Černoša (Avtor), Roman Jerala (Mentor), Roman Jerala (Član komisije za zagovor), San Hadži (Član komisije za zagovor), Mojca Narat (Član komisije za zagovor), Tom Turk (Član komisije za zagovor), San Hadži (Komentor)

Povzetek

Sistemi toksin-antitoksin so sestavljeni iz genskih parov toksina, ki vpliva na metabolizem, ter antitoksina, ki regulira toksin in ga ob normalnih rastnih razmerah nevtralizira. Njihova najbolj splošno sprejeta funkcija je stabilizacija genskih elementov, druge predlagane funkcije obsegajo altruistično apoptozo, sodelovanje pri perzistenci ter obrambo pred fagi. Za modul toksin-antitoksin higBA2 iz Vibrio cholerae je značilna regulacija z negativno kooperativnostjo, ki jo povzroča N-končna intrinzično nestrukturirana domena antitoksina HigA2. Ta se izključujoče veže na toksin HigB2 (s čimer izniči endonukleazno aktivnost toksina) ali sodeluje pri vezavi antitoksina na operatorsko regijo (s čimer ojača represijo modula higBA2). Za analizo regulacije modula higBA2 smo izdelali vektorske konstrukte v Escherichia coli, v katerih je izražanje RFP vezano na operator modula higBA2, toksin HigB2 in antitoksin HigA2 pa sta pod različno močnimi konstitutivnimi promotorji in sta zaradi tega prisotna v različnih molskih razmerjih. Z merjenjem flourescence smo potrdili, da je antitoksin HigA2 močan represor operona higBA2, njegova nestrukturirana N-končna domena sodeluje pri vezavi na DNK, brez nje se antitoksin HigA2 na operatorsko regijo higBA2 veže šibkeje. Ob pribitku antitoksina HigA2 je bila represija modula higBA2 močnejša, pribitek toksina HigB2 v nasprotju z našo hipotezo ni zmanjšal represije modula higBA2, temveč jo je zvečal. Pri nizkih koncentracijah antitoksina smo opazili povečano aktivnost modula higBA2. Prisotnost modula higBA2 divjega tipa v Escherichia coli ni vplivala na tvorbo perzistentnih celic, modul tako ni primerna tarča za razvoj zdravil v boju proti perzistentnim sevom Vibrio cholerae.

Ključne besede

biotehnologija;genski inženiring;sistemi toksin-antitoksin;higBA2;negativna kooperativnost;perzistenca;

Podatki

Jezik:	Slovenski jezik
Leto izida:	2020
Tipologija:	2.09 - Magistrsko delo
Organizacija:	KI - Kemijski inštitut
Založnik:	[I. Černoša]
UDK:	602.64:579.8:604.4:579.1:544.01(043.2)
COBISS:	21863683
Št. ogledov:	561
Št. prenosov:	152
Ocena:	0 (0 glasov)
Metapodatki:

Ostali podatki

Sekundarni jezik:	Angleški jezik
Sekundarni naslov:	In vivo characterisation of regulation of toxin-antitoxin module higBA2 from Vibrio cholerae
Sekundarni povzetek:	Toxin-antitoxin systems consist of toxin and antitoxin gene pairs. Toxins affect cell metabolism, antitoxins regulate and neutralize toxin in normal growing conditions. Their most widely accepted function is stabilisation of gene elements, other proposed functions include altruistic cell death, role in persister cell formation and protection from bacteriophages. Toxin-antitoxin module higBA2 from Vibrio cholerae is characterised by regulation with negative cooperativity caused by HigA2 antitoxin’s N-terminal intrinsically disordered domain’s ability to exclusively bind to either toxin HigB2 (blocking toxin’s endonuclease activity) or contribute to antitoxins affinity for operator region (increasing repression of the higBA2 module). In order to analyse higBA2 module’s regulation, we have produced vector constructs in E. coli in which RFP expression is regulated by higBA2 module’s operator, toxin HigB2 and antitoxin HigA2 are expressed under constitutive promoters with different activities and are consequently present in different molar ratios. By measuring the fluorescence, we confirmed antitoxin HigA2 is a strong repressor of higBA2 operator, its N-terminal intrinsically disordered domain cooperates in antitoxin’s binding to DNA, without it antitoxin HigA2 binds to higBA2 operator region more weakly. At an overabundance of antitoxin HigA2 the repression of higBA2 module is stronger, overabundance of toxin HigB2, contrary to our hypothesis, does not lower higBA2 module’s repression, but rather increases it. At low antitoxin concentrations enhanced activity of higBA2 module was observed. The presence of wild type higBA2 module in E. coli did not affect persister cell formation, the module is therefore not a suitable target for the development of drugs combating V. cholerae presistence.
Sekundarne ključne besede:	biotechnology;genetic engineering;toxin-antitoxin systems;higBA2;negative cooperativity;bacterial persistence;
Vrsta dela (COBISS):	Magistrsko delo/naloga
Študijski program:	0
Konec prepovedi (OpenAIRE):	1970-01-01
Komentar na gradivo:	Univ. v Ljubljani, Biotehniška fak., Študij biotehnologije
Strani:	XII, 78 f., [8] f. pril.
ID:	11854150