Pomen določanja zunajceličnih veziklov za napovedovanje kemorezistence pri seroznem karcinomu jajčnikov visoke stopnje malignosti

magistrsko delo

Nuša Kelhar (Avtor), Katarina Černe (Mentor), Marko Dolinar (Član komisije za zagovor), Aljaž Gaber (Član komisije za zagovor), Borut Kobal (Komentor)

Povzetek

Serozni karcinom jajčnikov visoke stopnje malignosti (angl. high-grade serous ovarian carcinoma, HGSOC), glavni histološki podtip raka jajčnikov, je vodilni vzrok za smrt med ginekološkimi raki. Poleg poznega odkrivanja bolezni je glavni razlog za slabo prognozo kemorezistenca, hkrati pa ni na razpolago prediktivnega oz. napovednega biomarkerja za razvoj kemorezistence. Zunajcelični vezikli (ZV), ki jih izločajo celice, so prisotni v vseh telesnih tekočinah in omogočajo, v primerjavi z biopsijo, odvzem vzorca ob diagnozi, med zdravljenjem in po končanem zdravljenju. Molekule, ki jih nosijo ZV, naj bi odražale molekule iz celic, iz katerih izhajajo. Molekula EpCAM je povezana z epitelijskimi raki, kakšen je tudi HGSOC. Namen magistrskega dela je bil ugotoviti, ali ima koncentracija celokupnih ZV in EpCAM pozitivnih ZV potencial za napoved kemorezistence. Ker so velikosti ZV v nanometrskem območju, je njihova detekcija otežena, prav tako pa je zahtevna tudi njihova izolacija. Posledično je bil namen tudi optimizacija protokola za določanje ZV v kliničnih vzorcih. V raziskavo smo vključili tri človeške celične linije raka jajčnikov seroznega tipa: OAW28 (izolirana iz klinično potrjeno kemorezistentne bolnice s HGSOC), PEO1 (izolirana iz bolnice z napredovalim stadijem HGSOC in občutljive na zdravljenje s kemoterapijo) in OAW42 (izolirana iz bolnice z začetnim stadijem raka jajčnikov seroznega tipa in občutljive na zdravljenje s kemoterapijo). Poleg tega smo v raziskavo vključili vzorce ascitesa in plazme 12 bolnic z napredovalim stadijem HGSOC. Koncentracijo ZV smo določali z nano pretočno citometrijo (angl. nanoscale flow cytometry, NFC) in z analizo sledenja nanodelcem (angl. nanoparticle tracking analysis, NTA). Pri kliničnih vzorcih smo uporabili različne načine izolacije ZV. Pri PEO1 smo v primerjavi z ostalima dvema celičnima linijama določili najvišjo koncentracijo ZV (p < 0,001). Med koncentracijama ZV pri OAW28 in OAW42 ni bilo statistično značilne razlike (p > 0,05). Izražanje EpCAM je bilo na membrani OAW28 večje kot pri PEO1 (p < 0,01) in OAW42 (p < 0,001). Najvišjo koncentracijo in delež EpCAM pozitivnih ZV smo določili pri OAW28. Delež EpCAM pozitivnih ZV je bil pri OAW28 (45,01 %) višji kot pri PEO1 (10,0 %; p < 0,001) in OAW42 (3,7 %; p < 0,001). Koncentracije EpCAM pozitivnih ZV so bile pozitivno povezane z izražanjem EpCAM na celicah iz katerih ZV izvirajo (r = 0,99; p = 0,02). Z obema metodama detekcije smo ugotovili veliko raznolikost glede koncentracije ZV v kliničnih vzorcih. V ascitesu smo z NTA določili večjo povprečno velikost nanodelcev kot v plazmi (ascites: 130 ± 10,23 nm; plazma 70 ± 3,84 nm; p = 0,028). Med uporabljenimi izolacijskimi metodami smo z obema metodama detekcije določili največjo koncentracijo ZV pri izolaciji s filtracijo in najmanjšo pri izolaciji z ultracentrifugiranjem. Pri izolaciji s kromatografijo z ločevanjem po velikosti (angl. size exclusion chromatography, SEC) se je velikostna porazdelitev nanodelcev v plazmi povečala (p < 0,05). Z NFC smo določili manjšo koncentracijo kot pri NTA, vendar je bila med rezultati obeh metod prisotna pozitivna korelacija ( r = 0,85; p < 0,001). Z našo raziskavo smo ugotovili večjo koncentracijo in delež EpCAM pozitivnih ZV pri celični liniji, izolirani iz klinično potrjene kemorezistentne bolnice s HGSOC, medtem ko koncentracija celokupnih ZV ni bila večja. Obenem je koncentracija EpCAM pozitivnih ZV odražala izražanje EpCAM na membrani celic iz katerih so ZV izhajali. To je prva raziskava, ki dokazuje, da so EpCAM pozitivni ZV, ne pa tudi celokupni ZV, obetajoč prediktivni biomarker za napoved kemorezistence pri HGSOC. Na kliničnih vzorcih ascitesa smo ugotovili, da je možna direktna detekcija ZV z NFC na vzorcih, ki smo jih samo filtrirali. Ta ugotovitev je pomembna za kliniko, kjer mora biti analiza hitra in enostavna. Način izolacije in detekcije ZV močno vpliva na koncentracijo ZV, zato bi morali protokol za klinično določanje ZV dodatno optimizirati preden bi nadaljevali raziskave glede potenciala EpCAM pozitivnih ZV kot prediktivnega biomarkerja za napoved kemorezistence pri HGSOC.

Ključne besede

zunajcelični vezikli;epitelijska celična adhezijska molekula;EpCAM;analiza sledenja nanodelcev;nanopretočna citometrija;celične linije raka jajčnikov;magistrska dela;

Podatki

Jezik:	Slovenski jezik
Leto izida:	2022
Tipologija:	2.09 - Magistrsko delo
Organizacija:	UL FKKT - Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo
Založnik:	[N. Kelhar]
UDK:	576:618.11-006(043.2)
COBISS:	121476867
Št. ogledov:	25
Št. prenosov:	10
Ocena:	0 (0 glasov)
Metapodatki:

Ostali podatki

Sekundarni jezik:	Angleški jezik
Sekundarni naslov:	The significance of extracellular vesicles for prediction of chemoresistance in high grade serous ovarian carcinoma
Sekundarni povzetek:	High grade serous ovarian carcinoma (HGSOC) is the main histological subtype of ovarian cancer and the main cause of death out of all gynaecological cancers. Chemoresistance, along with late diagnosis, is the main cause for poor prognosis, while there is no predictive biomarker available for predicting chemoresistance. Extracellular vesicles (EV), released by cells, are present in all bodily fluids and enable sample collection at the time of diagnosis, during treatment and after treatment in contrast with biopsy. EV cargo molecules resemble molecules from parent tumour cells. EpCAM molecule is linked to epithelial cancers, including HGSOC. The aim of this study was to determine the potential of overall EV determination and EpCAM positive EV determination to predict chemoresistance. The size of EVs is in the nanometer scale, and so isolation and detection are challenging. Another aim of this study was to optimize the protocol for EV determination from clinical samples. In this study we included three serous ovarian cancer cell lines: OAW28 (isolated from clinically chemoresistant patient with HGSOC), PEO1 (isolated from patient with advanced HGSOC, who was sensitive to chemotherapy) and OAW42 (isolated from patient with early-stage cancer of serous type who was sensitive to chemotherapy). We also included 12 samples of ascites and plasma from advanced HGSOC patients. We determined the concentration of EV with nanoscale flow cytometry (NFC) and nanoparticle tracking analysis (NTA). We used different methods of EV isolation from clinical samples. The highest EV concentration was determined for cell line PEO1 compared to two other cell lines (p < 0,001). There was no statistically significant difference between EV concentrations for cell lines OAW28 and OAW42 (p > 0,05). EpCAM expression for cell line OAW28 was higher than for cell lines PEO1 (p < 0,01) and OAW42 (p < 0,001). The highest concentration and proportion of EpCAM positive EV was for cell line OAW28. The proportion of EpCAM positive EV was highest for OAW28 (45,0 %), compared to PEO1 (10,0 %; p < 0,001) and OAW42 (3,7 %, p < 0,001). EpCAM positive EV concentrations were positively correlated to EpCAM expression on the membranes of serous cancer cells, which EV originate from (r = 0,99; p = 0,02). Both methods of detection showed great diversity of EV concentrations. With NTA we determined higher average size of nanoparticles in ascites than in plasma (ascites: ascites: 130 ± 10,23 nm; plasma 70 ± 3,84 nm; p = 0,028). Out of all isolation methods we determined highest EV concentrations with filtration and lowest with ultracentrifugation. For isolation with size exclusion chromatography (SEC) size distribution of plasma nanoparticles increased (p < 0,05). NFC reported lower EV concentrations than NTA, but results between two methods gave a positive correlation (r = 0,85; p < 0,001). In this study we found that higher EV concentration and proportion of EpCAM positive EV were determined for the cell line, isolated from clinically confirmed chemoresistant HGSOC patient, while overall EV concentrations were not the highest. EpCAM positive EV concentration reflected EpCAM expression on the membrane of cells that EV originated from. This is the first research that shows EpCAM positive EV concentration but not overall EV concentration is a promising predictive biomarker for chemoresistance in HGSOC. EV detection with NFC is possible for clinical samples of ascites with filtration as an isolation method. This is important for clinical application, where an analysis has to be quick and simple. Methods for EV isolation and methods for EV detection greatly affect measured EV concentrations, so the protocol for clinical determination should be additionally improved before we can continue the research of EpCAM positive EV concentration potential as a predictive biomarker for chemoresistance in HGSOC.
Sekundarne ključne besede:	ovarian cancer;extracellular vesicles;EpCAM;nanoparticle tracking analysis;nanoscale flow cytometry;Novotvorbe jajčnikov;Univerzitetna in visokošolska dela;
Vrsta dela (COBISS):	Magistrsko delo/naloga
Študijski program:	1000377
Konec prepovedi (OpenAIRE):	1970-01-01
Komentar na gradivo:	Univ. v Ljubljani, Fak. za kemijo in kemijsko tehnologijo, smer Biokemija
Strani:	108 str.
ID:	16279655