Purification and biochemical characterization of bacterial glycosyltransferase

diplomsko delo univerzitetnega študijskega programa

Deja Kokot (Avtor), Uroš Potočnik (Mentor)

Povzetek

It has been estimated that over half of all proteins found in nature are glycosylated, with more than three quarters of these containing N-linked carbohydrates. N-Glycosylation, one of the most common and yet complex forms of post-translational modification, is involved in many cellular processes including protein folding, protein secretion, intracellular trafficking and cell communication. Sialic acids form diverse family of negatively charged sugars that play essential biological roles. Their synthesis is regulated by large set of enzymes. Sialyltransferases are key enzymes for the biosynthesis of sialic acid-containing molecules, which have been implicated in various biological and phatological processes including cell-cell recognition, cell growth and differentiation, cancer metastasis, immunological regulation, as well as bacterial and viral infection. They transfere sialic acid residue, usually from an activated sugar nucleotide donor cytidine 5'monophosphate sialic acid (CMP-Sia) to a suitable acceptor to formation of a sialyl linkage with high stereo and regio-selectivity. Several eukaryotic and bacterial sialyltransferases have been described up to date. All eukaryotic sialyltransferases are grouped into a single glycosyltransferase family GT29 based on their sequence similarities. However on the other hand, bacterial sialyltransferases indentified up to date have been grouped into four glycosyltransferase families including GT38, GT42, GT52 and GT80. The aim of this work was the indentification, purification, expression and biochemical characterization of a new member of GT80 family sialyltransferase from Pasteurella dagmatis. In this work we describe a new bacterial sialyltransferase beta-galactoside alpha-2,3-sialyltransferase, a bacterial sialyltransferase obtained from Pasteurella dagmatis and a member of a GT80 family based on its sequence similarity. It is multifunctional enzyme which has four major activities including α2,3-sialyltransferase, α2,3-sialidase, α2,3-trans-sialidase acitivities and CMP-Neu5Ac hydrolase activity. It was estimated that it has also α2,6-sialidase activity but this activity in comparison with other four activities is negligible.

Ključne besede

glycosyltransferase;pasteurela dagmagtis;sialytransferase;N-glycans;sialic acid;

Podatki

Jezik:	Angleški jezik
Leto izida:	2012
Izvor:	Maribor
Tipologija:	2.11 - Diplomsko delo
Organizacija:	UM FKKT - Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo
Založnik:	[D. Kokot]
UDK:	577.21(043.2)
COBISS:	16059670
Št. ogledov:	2212
Št. prenosov:	51
Ocena:	0 (0 glasov)
Metapodatki:

Ostali podatki

Sekundarni jezik:	Slovenski jezik
Sekundarni naslov:	Čiščenje in biokemijska karakterizacija bakterijske glikoziltransferaze
Sekundarni povzetek:	Ocenjeno je bilo, da je več kot polovica proteinov v naravi glikoliziranih. Več kot tri četrtine le-teh vsebuje N-vezane ogljikove hidrate. N-glikozilacija je ena najpomembnejših posttranslacijskih dogodkov in je na kompleksen način vključena v številne celične procese, vključno s formiranjem proteinov, izločanjem proteinov, znotrajcelično in medcelično komunikacijo. Dokazov, kako pomembna je N-glikozilacija pri vzpostavitvi pravilne tridimenzionalne strukture oziroma konformacije in funkciji glikoproteinov, je ogromno. Na splošno N-glikani omogočajo stabilnost glikoproteinov, na katere so vezani. Glikoziltransferaze so velika skupina encimov, ki primarno omogočajo biosintezo glikanov. Njihova skupna značilnost je, da katalizirajo prenos preprostega monosaharida od aktivne donorske molekule do akceptorskega substrata, pri čemer je formirana glikozidna vez. Ti encimi so prisotni tako v prokariontih kot tudi v evkariontih, kjer kažejo specifičnost za glikozidne donorje in akceptorske substrate. Glikoziltransferaze so klasificirane v družine glede na podobnost aminokislinske sekvence. Kljub velikemu številu sekvenčnih družin, ki so bile karakterizirane, pa strukturne analize kažejo omejeno število struktur. Sialiltransferaze so ključni encimi za biosintezo sialooligosaharidov, sialopolisaharidov in sialoglikokonjugatov, kateri imajo osrednjo vlogo v mnogih kritičnih fizioloških in patoloških procesih v naravi. Produkti encimskih reakcij so pomembne molekule v različnih bioloških procesih, kot npr. celična komunikacija in celične interakcije. Do danes je bilo izoliranih mnogo sialiltransferaz iz evkariontskih in prokariontskih celic. Ti encimi so bili klasificirani v štiri družine glede na vez, ki jo tvorijo med sintezo produkta. Encimi so bili klasificirani tudi glede na sekvenčno podobnost in tako so bili razvrščeni v pet družin. Sialiltransferate katalizirajo prenos ostanka sialične kisline (Nau5Ac), ki je najpogosteje uporabljena sialična kislina, od aktiviranega citidin 5'-monofosfata (CMP-Neu5Ac) do primernega akceptorja za tvorbo vezi. Kljub pomembni biološki vlogi sialiltransferaz in velikemu interesu o poznavanju le-teh pa je le malo znanega o mehanizmu reakcij, ki jih katalizirajo ti encimi. Bakterijski encim PdST3je bil izoliran iz Pastuerelle dagmatis s predpostavko, da bo mutiran, saj smo strmeli k čim večji aktivnosti encima. Na podlagi objavljenih raziskav smo se odločili mutirati treonin na aktivnem mestu encima in tako primerjati wild type z mutantom. Štiri glavne funkcije so bile najdene v primeru obeh encimov, in sicer α2,3-sialiltransferazna, α2,3-sialidazna, α2,3-trans-sialilacijska aktivnost in CMP-Neu5Ac hidrolizna aktivnost. Ugotovljeno je bilo, da imata tudi α2,6-sialidazno aktivnost, vendar je ta aktivnost v primerjavi z drugimi štirimi aktivnostmi zanemarljiva. Zelo nenavadno je, da ima en sam encim tako veliko različnih funkcij.
Sekundarne ključne besede:	biokemija;bakterijska glikoziltransferaza;
URN:	URN:SI:UM:
Vrsta dela (COBISS):	Diplomsko delo
Komentar na gradivo:	Univ. v Mariboru, Fak. za kemijo in kemijsko tehnologijo
Strani:	IV, 74 f.
Ključne besede (UDK):	mathematics;natural sciences;naravoslovne vede;matematika;biological sciences in general;biologija;material bases of life;biochemistry;molecular biology;biophysics;biokemija;molekularna biologija;biofizika;
ID:	1003399