Inaktivacija gena metiltransferaze oxyF iz genske skupine za biosintezo oksitetraciklina v bakteriji Streptomyces rimosus

magistrsko delo

Alen Pšeničnik (Avtor), Matej Butala (Recenzent), Hrvoje Petković (Mentor), Hrvoje Petković (Član komisije za zagovor), Mojca Narat (Član komisije za zagovor), Matej Butala (Član komisije za zagovor)

Povzetek

Streptomyces rimosus je pomemben industrijski mikroorganizem, ki proizvaja oksitetraciklin, antibiotik širokega spektra. V medicini in veterini se trenutno uporablja več polsinteznih tetraciklinksih antibiotikov. Zaradi širjenja bakterijske rezistence narašča interes po odkritju novih naravnih tetraciklinov in njihovih biosinteznih intermediatov, uporabnih za razvoj novih, bolj učinkovitih antibiotikov. Cilj tega dela je bila inaktivacija gena metiltransferaze oxyF znotraj genske gruče za biosintezo oksitetraciklina in identifikacija tarčnega produkta, 6-demetiloksitetraciklina. Konstruirali smo plazmid, ki vsebuje DNK fragment s homologijo regijam v okolici gena oxyF v genomu S. rimosus, vendar brez večjega dela gena oxyF. Na ta način konstruiran fragment DNK smo nato vstavili v »samomorilski« plazmid, imenovan pKC1139. pKC1139 vsebuje mesto za podvojevanje v E. coli in primerne gene za rezistenco na antibiotike, ki omogočajo selekcijo v E .coli in S. rimosus. Po transformaciji v S. rimosus smo uporabili dvostopenjski proces z integracijo v genom, ki ji je sledila delecija večjega dela gena oxyF, oboje preko homologne rekombinacije. Nato smo poiskali transformante S. rimosus z natančno inaktivacijo gena oxyF. Po kultivaciji smo analizirali metabolni profil izbranih kolonij z tankoplastno kromatografijo. Z uporabo masne spektrometrije smo potrdili produkcijo sicer nizkih količin 6-demetil oksitetraciklina.

Ključne besede

aktinomicete;Streptomyces rimosus;tetraciklini;inaktivacija gena;metiltransferaza;oksitetraciklin;

Podatki

Jezik:	Slovenski jezik
Leto izida:	2019
Tipologija:	2.09 - Magistrsko delo
Organizacija:	UL BF - Biotehniška fakulteta
Založnik:	[A. Pšeničnik]
UDK:	602.3:579.873.7:602.6:579.8(043.2)
COBISS:	9238905
Št. ogledov:	1548
Št. prenosov:	3
Ocena:	0 (0 glasov)
Metapodatki:

Ostali podatki

Sekundarni jezik:	Angleški jezik
Sekundarni naslov:	Inactivation of methyltrasferase [!] oxyF gene from oxytetracycline biosynthesis gene cluster in Streptomyces rimosus bacteria
Sekundarni povzetek:	Streptomyces rimosus is an important industrial microorganism producing broad-spectrum antibiotic oxytetracycline. A number of semi-synthetic tetracyclines, are currently used in human and veterinary medicine. Due to emerging bacterial resistance, there is rising interest for new natural tetracyclines and their biosynthetic intermediates, which could be used to develop novel and more effective antibiotics . The aim of this work was to inactivate methyltransferase oxyF gene within oxytetracycline gene cluster in S. rimosus and to potentially identify target product, 6-desmethyl oxytetracycline. We consteructed a plasmid containing DNA fragment with homology to the sequence adjacent to oxyF gene from S. rimosus genome, but missing the entire oxyF gene. This way constructed DNA fragment was inserted into »suicide« plasmid designated as pKC1139, containing E. coli origin of replication and suitable resistance markers for selection in E. coli and S. rimosus. We transformed the plasmid into S.rimosus, and by applying two-stage process of chromosomal integration, followed by a double cross-over deletion, we selected for S. rimosus transformants containing precise deletion of targeted oxyF gene. We then confirmed correct double-cross over deletion of oxyF gene in a number of S. rimosus colonies. After cultivation, we analyse metabolic profile of the selected engioneered strains by thin layer chromatography. Although at low yield, we confirmed production of 6-dsemethyl oxyteracycline by mass spectroscopy.
Sekundarne ključne besede:	actinomicetes;tetracyclines;gene inactivation;methyltransferase;oxytetracycline;
Vrsta dela (COBISS):	Magistrsko delo/naloga
Študijski program:	0
Konec prepovedi (OpenAIRE):	2022-06-13
Komentar na gradivo:	Univ. v Ljubljani, Biotehniška fak., Študij biotehnologije
Strani:	XI, 64 f.
ID:	11159809