Razvoj analiznih metod za določevanje analitov v medu

magistrsko delo

Helena Jakše (Avtor), Mitja Kolar (Mentor), Brigita Lenarčič (Član komisije za zagovor), Drago Kočar (Član komisije za zagovor), Marko Novinec (Komentor)

Povzetek

Med je naravni kompleksni produkt čebel, ki nastane s procesiranjem nektarja ali mane. Sestavljen je iz vode, različnih sladkorjev, proteinov, organskih kislin, anorganskih mineralov in kovinskih kationov v sledovih. Prav slednji bi lahko služili za okoljski monitoring, saj lahko z določanjem njihove koncentracije v medu iz različnih geografskih območij spremljamo onesnaženost okolja. V medu se v manjših količinah nahajajo tudi proteini in peptidi, ki s svojim specifičnim biološkim delovanjem prispevajo k farmakološkim aktivnostim medu. Peptidi s protimikrobnim delovanjem so predvsem čebeljega izvora, torej izločki njihovih hipofaringealnih žlez, ki presnavljajo surovi med. Da bi lahko vzpostavili uporabne modele za določevanje botaničnega izvora medu in okoljskega monitoringa, smo med različnega botaničnega in geografskega porekla analizirali z optično emisijsko spektroskopijo z induktivno sklopljeno plazmo (ICP-OES). Na podlagi pridobljenih rezultatov smo skušali najti povezavo med vsebnostjo kovin in okoljskim onesnaženjem. Izkazalo se je, da obstaja povezava med vsebnostjo svinca in aluminija glede na vsebnost antimikrobnih peptidov v medu. Za preučevanje peptidov v medu je pomembna njihova dobra ločba in vizualizacija. Osredotočili smo se na peptide manjše od 10 kDa, izmed katerih jih ima veliko tudi biološke učinke. Optimizirali smo nov protokol za poliakrilamidno gelsko elektroforezo z dodatkom natrijevega dodecilsulfata (NaDS-PAGE). Klasična metoda na osnovi glicinskega pufrskega sistema ni primerna, zato smo uporabili tricinski pufer. Poleg tega barvanje z Coomasssie Brillliant Blue barvilom ni primerno za vizualizacijo peptidov nizkih koncentracij zaradi prenizke občutljivosti, zato smo uporabili in optimizirali barvanje s srebrovim barvilom. Tako smo uspešno ločili peptidni lisi velikosti 5 in 7 kDa. Na osnovi literature sklepamo, da peptidno liso velikosti 5 kDa predstavljata defenzin-1 in apisimin. Kateri proteini naj bi sestavljali peptidno liso velikosti 7 kDa iz literature ni bilo moč ugotoviti, saj kolikor je nam znano, omenjena proteinska lisa v medu še ni bila opažena in predstavlja pomembno novost našega raziskovalnega dela. Eksperimentalne rezultate smo kvantificirali v programu QuantityOne (Bio-Rad, ZDA) in pri tem kot pozitivno kontrolo uporabili matični mleček, saj vsebuje visoko vsebnost defenzina-1 in apisimina. Koncentracijo peptidnih lis smo podali kot ekvivalent ustrezne proteinske lise v znani količini matičnega mlečka. Rezultati so pokazali, da v referenčnem matičnem mlečku najdemo proteinsko liso 5 kDa, ne pa tudi 7 kDa. Nasprotno je v medu proteinska lisa 5 kDa prisotna v zgolj v sledovih, več pa je proteinske lise 7 kDa. Obe se v medu pojavljata neodvisno od njegovega geografskega in botaničnega izvora, saj med posameznimi kategorijami nismo določili statistično značilnih razlik.

Ključne besede

med;kovine v medu;peptidi;proteini;antibakterijske komponente;defenzin-1;apisimin;analizne metode;optična emisijska spektroskopija;induktivno sklopljena plazma;ICP-OES;poliakrilna gelska elektroforeza;NADS-PAGE;magistrska dela;

Podatki

Jezik:	Slovenski jezik
Leto izida:	2019
Tipologija:	2.09 - Magistrsko delo
Organizacija:	UL FKKT - Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo
Založnik:	[H. Jakše]
UDK:	543.42:57.088.6:638.16(043.2)
COBISS:	1538506691
Št. ogledov:	722
Št. prenosov:	158
Ocena:	0 (0 glasov)
Metapodatki:

Ostali podatki

Sekundarni jezik:	Angleški jezik
Sekundarni naslov:	Analytical Methods for Determining Analytical Markers in Honey
Sekundarni povzetek:	Honey is a complex natural bee product, produced by processing of nectar and excretions of insects. It consists of water, various sugars, proteins, organic acids, minerals and trace metals. The latter could be utilized for environmental monitoring, as environmental pollution can be monitored by determining the concentration of heavy metals in honey. Smaller quantities of peptides are also present in honey, which through their antimicrobial and anti-inflammatory action contribute to the pharmacological activity of honey. They are mostly peptides of animal origin, particularly excrements of bee hypopharyngeal glands, which process the raw honey. In order to establish useful models for determining the botanical source of honey and its usefulness for environmental monitoring, different honey samples were analysed with optical inductive coupled plasma emission spectrometry (ICP-OES). With the use of statistical analyses, we determined the variance between the concentrations of different elements in terms of geographical and botanical origin. Based on the results obtained, we tried to find a link between the content of heavy metals and environmental pollution. The content of various elements, especially heavy metals, can serve not only as a botanical and authenticy marker, but also as an indicator for environmental monitoring. To study peptides in honey, their separation and visualization are important. We focused on peptides below the size of 10 kDa and optimized a new protocol for SDS-PAGE since the classic glycine-based buffer system is not suitable. With tricine-SDS-PAGE we successfully separated two bands of peptides with apparent molecular masses of 5 kDa and 7 kDa and visualized them with silver staining. The peptide band of 5 kDa likely corresponds to defensin-1 and/or apisimin according to literature. Because the detection limit of Coomassie Brilliant Blue staining is insufficient for visualization of peptides with low concentrations, we also optimized the staining process using staining with silver nitrate. The results were quantified using QuantityOne software (Bio-Rad, ZDA) and royal jelly as control, since it is rich in protein and contains a high content of defensin-1. The concentrations of separated peptides were calculated by referencing royal jelly with a known concentration of defensin-1 peptide. The results showed the presence of the 5 kDa peptide band in the royal jelly sample, but no 7 kDa peptide band. In honey, the 7 kDa band was stronger than the 5 kDa peptide band, which was present only in small amounts. Both peptide bands were present in samples independently of botanic or geographic origin with no statistically significant differences between them.
Sekundarne ključne besede:	honey;metals;peptides;apisimin;defensin;SDS-PAGE;ICP-OES;
Vrsta dela (COBISS):	Magistrsko delo/naloga
Študijski program:	1000377
Konec prepovedi (OpenAIRE):	1970-01-01
Komentar na gradivo:	Univ. v Ljubljani, Fak. za kemijo in kemijsko tehnologijo, smer Biokemija
Strani:	63 str.
ID:	11339099