Izbitje genske gruče SNORD116 iz Prader-Willi lokusa v sesalskih celičnih linijah

diplomsko delo

Povzetek

Prader-Willijev sindrom (PWS) je kompleksna multisistemska genetska bolezen, ki povzroča nevrološke, metabolne, endokrine in vedenjske motnje. Bolezen je posledica pomanjkanja izražanja očetovsko podedovanih genov na 15q11.2-q13 genomski regiji. Številne študije z mikrodelecijami so zožile kritično regijo PWS na gručo genov SNORD116, ki predstavlja glavno genetsko determinanto bolezni. Gensko gručo SNORD116 sestavlja 29 homologov, ki spadajo v družino malih nukleolarnih RNA s C/D ohranjenim motivom. Sekvenca SNORD116 ni komplementarna nobeni od kanoničnih RNA-tarč, zato ostaja biološka funkcija teh nekodirajočih RNA še neznana. Ravno iz tega razloga je ena izmed najpomembnejših nalog raziskav na tem področju iskanje in ovrednotenje nekanoničnih RNA-tarč iz družine SNORD116, ki bi bistveno pripomogle k določitvi vloge genske gruče pri patofiziologiji bolezni. V diplomskem delu smo s tehnologijo scCRISPR poskušali ustvariti celični liniji NTERA2/D1 in SH-SY5Y z izbitima genskima gručama SNORD116. Celična modela bi služila kot osnova za nadaljnje raziskovanje in validiranje najbolj verjetnih potencialnih tarč družine SNORD116. S pomočjo spletnih orodij smo na lokusu PWS izbrali tarčna zaporedja in načrtali sgRNA, ki smo jih nato s PCR amplificirali ter podaljšali, da smo dobili ustrezne komponente za sistem scCRISPR. Po tem, ko smo pripravili vse komponente in preverili njihovo ustreznost, smo z različnimi metodami optimizirali učinkovitost transfekcije pri obeh celičnih linijah. Plazmida in konstrukta sgRNA smo nato z načinom, ki se je izkazal za najbolj učinkovitega, vnesli v celice in preverjali, če so komponente sistema scCRISPR povzročile izbitje genske gruče SNORD116 v celičnem okolju. Za preverjanje smo uporabljali posamezne izolirane klone, pri katerih smo s specifičnimi začetnimi oligonukleotidi analizirali spremembe na genomski DNA na lokusu PWS. Izbitje genske gruče SNORD116 ni bilo uspešno pri nobeni od izbranih celičnih linij, najverjetnejši vzrok za negativen rezultat pa je prenizka učinkovitost transfekcije. Kljub temu, da nismo uspeli izdelati željenih celičnih modelov, smo v diplomskem delu uspešno vzpostavili sistem in metode potrebne za spreminjanje genoma s sistemom CRISPR/Cas9. Poleg tega smo optimizirali metode za preverjanje vnosa mutacij in selekcioniranja ter generiranja posameznih klonov. Naše ugotovitve bodo služile kot osnova za nadaljnje poskuse izbitja večjih genskih segmentov v celičnem okolju in s tem generiranjem modelov, ki nam bodo v prihodnje pomagali pri odkrivanju biološke vloge te enigmatične genske gruče.

Ključne besede

genetske bolezni;Prader-Willijev sindrom;genski lokus PWS;SNORD116;scCRISPR;NTERA-2/D1;SH-SY5Y;diplomska dela;

Podatki

Jezik:	Slovenski jezik
Leto izida:	2020
Tipologija:	2.11 - Diplomsko delo
Organizacija:	UL FKKT - Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo
Založnik:	[L. Knez]
UDK:	577.21:616.8-056.7(043.2)
COBISS:	32551683
Št. ogledov:	429
Št. prenosov:	153
Ocena:	0 (0 glasov)
Metapodatki:

Ostali podatki

Sekundarni jezik:	Angleški jezik
Sekundarni naslov:	Deletion of SNORD116 gene cluster from the Prader-Willi locus in mammalian cell lines
Sekundarni povzetek:	Prader-Willi syndrome (PWS) is a complex multisystemic genetic disorder with implications on the endocrine and neurologic systems, metabolism, and behaviour. PWS arises from the lack of expression of genes on the paternally derived chromosome 15q11.2-q13. Cases harbouring microdeletions narrowed the PWS critical region to the SNORD116 family, which is the primary genetic determinant of the PWS phenotype. SNORD116 gene cluster consists of 29 homologous genes that belong to the group of C/D-box small nucleolar RNAs. Since SNORD116 lacks obvious antisense elements against canonical RNA targets, its biological function remains largely unknown. For this reason, one of the most important tasks in this field of research is to identify the non-canonical RNA targets of SNORD116 that would significantly help determine the role of this gene cluster in the pathophysiology of the disease. Within this work, we wanted to create SNORD116 knock-out cell models using the scCRISPR method in NTERA2/D1 and SH-SY5Y cell lines. The cellular models would serve as a basis for further research and validation of the most probable potential targets of SNORD116. Firstly, we selected target sequences at the PWS locus and designed sgRNAs, which were then amplified and extended by PCR to obtain the appropriate components for the scCRISPR system. After we prepared and validated all components, we tried to optimize the transfection efficiency in both cell lines with various methods. Both plasmids and sgRNA constructs were then introduced into cells with the method that proved to be the most effective. To check if the scCRISPR system caused the desired deletion in target cells we analysed changes in genomic DNA at the PWS locus in individual isolated clones by PCR with specific primers. Unfortunately, the deletion of SNORD116 was unsuccessful in both of the selected cell lines, most likely due to low transfection efficiency. Despite the fact that we were not able to create the desired cell models, we successfully optimized the CRISPR/Cas9 system and methods needed for site-directed genome editing. In addition, we optimized methods to verify mutations and methods for the selection and generation of individual clones. We believe our work provides good basis for further knock-out experiments and thus generation of cell models that will help us discover the biological role of this enigmatic gene cluster.
Sekundarne ključne besede:	Prader-Willi syndrome;SNORD116;scCRISPR;NTERA2/D1;SH-SY5Y;
Vrsta dela (COBISS):	Diplomsko delo/naloga
Študijski program:	1000371
Konec prepovedi (OpenAIRE):	1970-01-01
Komentar na gradivo:	Univ. v Ljubljani, Fak. za kemijo in kemijsko tehnologijo, UNI Biokemija
Strani:	66 str.
ID:	12033165