magistrsko delo
Kaja Zevnik (Avtor), Uroš Petrovič (Recenzent), Tatjana Avšič-Županc (Mentor), David Dobnik (Komentor)

Povzetek

Izvedli smo karakterizacijo rekombinantnih vektorjev adenovirusom pridruženih virusov (rAAV) serotipa 9 s pomočjo metod digitalna kapljična verižna reakcija s polimerazo (ddPCR), kvantitativna PCR (qPCR), encimskoimunski test (ELISA) in presevna elektronska mikroskopija (TEM). Preučili smo štiri različne frakcije (težka, polna, srednja, prazna) dveh vrst vektorjev, enoverižnih AAV (ssAAV) in samokomplementarnih AAV (scAAV). Frakcije so bile pridobljene po čiščenju z gostotnim gradientnim ultracentrifugiranjem s CsCl. Pričakovali smo, da bo karakterizacija virusnih vektorjev z različnimi metodami omogočila določitev razlik med posameznimi frakcijami. V polni frakciji smo pričakovali najvišji delež polnih kapsid ter najmanjšo vsebnost nečistot. Poleg tega pa smo pričakovali, da bodo korelacije med posameznimi metodami specifične za posamezno vrsto vektorja. Pokazali smo razlike v sestavi posameznih frakcij, vendar razlike niso bile tako velike, kot smo pričakovali. Pokazali smo, da ima polna frakcija najnižjo vsebnost nečistot, najvišjo pa težka oziroma prazna frakcija. Za vektorje ssAAV smo pokazali, da najvišjo koncentracijo polnih kapsid vsebuje polna frakcija. Pri vektorjih scAAV smo določili najvišjo koncentracijo polnih delcev v polni in srednji frakciji. Najvišji delež praznih delcev smo za obe vrsti vektorjev določili v prazni frakciji. Izkazalo se je, da so bile pri scAAV manjše razlike med frakcijami. V povprečju smo pri scAAV določili višje vrednosti titrov kapsid in virusnih genomov ter nižje vrednosti nečistot v primerjavi z ssAAV. Pokazali smo, da se metode med seboj dopolnjujejo, obstajajo pa tudi korelacije med njimi. Za karakterizacijo virusnih vektorjev za gensko terapijo je tako ključna uporaba različnih pristopov na različnih nivojih.

Ključne besede

genska terapija;virusni vektorji;AAV;ddPCR;ELISA;TEM;

Podatki

Jezik: Slovenski jezik
Leto izida:
Tipologija: 2.09 - Magistrsko delo
Organizacija: UL MF - Medicinska fakulteta
Založnik: [K. Zevnik]
UDK: 602.641:606:616-056.7
COBISS: 107562243 Povezava se bo odprla v novem oknu
Št. ogledov: 140
Št. prenosov: 60
Ocena: 0 (0 glasov)
Metapodatki: JSON JSON-RDF JSON-LD TURTLE N-TRIPLES XML RDFA MICRODATA DC-XML DC-RDF RDF

Ostali podatki

Sekundarni jezik: Angleški jezik
Sekundarni naslov: Comparison of different approaches for characterisation of viral vectors for gene therapy
Sekundarni povzetek: We performed characterization of recombinant vectors of serotype 9 adeno associated virus (rAAV) with methods such as digital droplet polymerase chain reaction (ddPCR), quantitative PCR (qPCR), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and transmission electron microscopy (TEM). We studied four different fractions (heavy, full, intermediate, empty) of two types of vectors, single-stranded AAV (ssAAV) and self-complementary AAV (scAAV). Fractions were collected after purification by density gradient ultracentrifugation with CsCl. We expected that characterization of viral vectors with different methods would result in determination of the differences between individual fractions. We expected the highest concentration of full capsids and the lowest content of impurities in full fraction. We expected that individual methods would correlate with each other according to the type of vector. Our study showed differences in the composition of individual factions, although they were not as high as expected. The lowest content of impurities was determined in full fraction. The highest content of impurities was determined in heavy and empty fractions. We showed that full fraction contains the highest concentration of full capsids if ssAAV vectors are used. On the other hand, full and intermediate fractions contain the highest concentration of full capsids if scAAV vectors are used. The highest percentage of empty particles was determined in empty fraction for both types of vectors. There were smaller differences between fractions with scAAV, which contained higher values of capsid and viral genome titers and lower concentrations of impurities compared to ssAAV. We have shown that the methods complement each other and that there are correlations between them. In conclusion, the use of various approaches at different levels is crucial for characterization of viral vectors for gene therapy.
Sekundarne ključne besede: gene therapy;viral vectors;AAV;ddPCR;ELISA;TEM;
Vrsta dela (COBISS): Magistrsko delo/naloga
Študijski program: 0
Komentar na gradivo: Univ. v Ljubljani, Biotehniška fak., Oddelek za mikrobiologijo
Strani: XIV f., 75 str., [7] str. pril.
ID: 15288107