Povezave med strukturo in funkcijo metakaspaz CrMCA-I in CrMCA-II iz alge Chlamydomonas reinhardtii

magistrsko delo

Lana Vogrinec (Avtor), Marina Klemenčič (Mentor), Marko Novinec (Član komisije za zagovor), Marko Dolinar (Član komisije za zagovor)

Povzetek

Metakaspaze so cisteinske proteaze, ki se na osnovi strukturne homologije s kaspazami uvrščajo v družino C14 klana CD. Najdemo jih pri raznovrstnih organizmih, med drugim pri bakterijah, arhejah, algah, enoceličnih evkariontih in rastlinah, ne pa tudi pri živalih. Poleg kaspazam homolognih domen p20 in p10 lahko vsebujejo tudi nekatere dodatne regije, glede na katere se delijo na tri tipe: tip I, tip II in tip III. Metakaspaze se od kaspaz razlikujejo v specifičnosti, saj za razliko od slednjih cepijo substrate z bazičnimi aminokislinskimi ostanki na mestu P1. Poleg tega metakaspaze za razliko od kaspaz za aktivacijo večinoma potrebujejo Ca2+, nekatere pa so podvržene tudi specifičnim cepitvam. Te so še posebej značilne za metakaspaze tipa II, kjer je avtoprocesiranje za ohranjenim bazičnim aminokislinskim ostankom v povezovalni regiji ključno za aktivacijo. Namen magistrske naloge je bil raziskati povezavo med značilnimi strukturnimi elementi metakaspaz in njihovo vlogo pri aktivnosti oziroma aktivaciji. Bioinformacijsko smo analizirali ohranjenost posameznih aminokislinskih ostankov znotraj različnih tipov metakaspaz. Na osnovi teh analiz smo izbrali aminokislinske ostanke, ki bi lahko bili pomembni za specifične lastnosti metakaspaz CrMCA-I in CrMCA-II iz alge Chlamydomonas reinhardtii. Pripravili smo nukleotidna zaporedja z uvedenimi točkovnimi mutacijami, pri čemer smo v zapisu za CrMCA-I mutirali ostanke, povezane s specifičnostjo in aktivacijo, pri CrMCA-II pa z avtoprocesiranjem. Izolirali smo skrajšan rekombinantni protein CrMCA-I ter njegove mutante. Primerjali smo aktivnost izoliranih proteinov na proteinske in peptidne substrate ter določili kinetične parametre za cepitev izbranih sintetičnih substratov. Ugotovili smo, da so vsi mutanti sposobni cepitve večjih proteinskih substratov, medtem ko so v primerjavi z izhodiščnim encimom slabše aktivni na sintetične metakaspazne substrate. Prav tako noben od mutantov ni sposoben cepiti kaspaznih substratov. Poleg tega smo uspešno izolirali tudi protein CrMCA-II, ne pa tudi njegovih mutantov. Analizirali smo stopnjo avtoprocesiranja CrMCA-II pri različnih temperaturah in koncentracijah Ca2+. Dokazali smo, da se v prisotnosti Ca2+ divji tip CrMCA-II takoj razcepi na dva fragmenta, kar je opazno že pri 4 °C. Pri temperaturi nad 18 °C in 10-minutni inkubaciji pride do dodatnih cepitev, sčasoma pa se encim popolnoma razgradi.

Ključne besede

Chlamydomonas reinhardtii;regulirana celična smrt;metakaspaze;CrMCA-I;CrMCA-II;magistrska dela;

Podatki

Jezik:	Slovenski jezik
Leto izida:	2022
Tipologija:	2.09 - Magistrsko delo
Organizacija:	UL FKKT - Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo
Založnik:	[L. Vogrinec]
UDK:	577.15(043.2)
COBISS:	121487363
Št. ogledov:	12
Št. prenosov:	10
Ocena:	0 (0 glasov)
Metapodatki:

Ostali podatki

Sekundarni jezik:	Angleški jezik
Sekundarni naslov:	Relationship between structure and function in metacaspases CrMCA-I and CrMCA-II from the alga Chlamydomonas reinhardtii
Sekundarni povzetek:	Metacaspases are cysteine proteases, which are structural homologues of caspases and therefore belong to the C14 family of the CD clan. They can be found in various organisms, including bacteria, archaea, algae, and unicellular eukaryotes, but not in metazoa. In addition to caspase-specific domains p20 and p10, they can contain other regions, based on which they are classified as type I, type II and type III. Unlike caspases, they preferentially cleave substrates with basic amino acid residues in the P1 position. Additionally, most metacaspases require calcium for activation, while some also undergo specific autoprocessing. This is particularly true of type II metacaspases, which have been shown to require cleavage after a conserved basic amino acid residue in the linker region for activation. The aim of this thesis was to study the structure-function relationship of metacaspase-specific structural elements and to discover their role in activity and activation. We performed an in silico analysis of various amino acid sequences of type I and type II algal metacaspases and identified conserved amino acid residues. Based on the analysis, we identified specific residues in the model metacaspases CrMCA-I and CrMCA-II from the algae Chlamydomonas reinhardtii, which could play an important role in their function. Furthermore, we constructed mutants by introducing point mutations. For CrMCA-I we mutated amino acids, involved in specificity and activation, while for CrMCA-II we selected residues, that could represent potential cleavage sites during activation. We isolated recombinant CrMCA-I_CL and its mutants. Next, we compared the activity of the isolated enzymes towards protein and peptide substrates and determined the kinetic parameters for the cleavage of selected synthetic substrates. We discovered that while all the mutants can cleave large protein substrates, their activity towards peptide substrates is lower in comparison to the initial protein. Additionally, we isolated and purified CrMCA-II, but were unsuccessful with the isolation of its mutants. We analysed the rate of autoprocessing of CrMCA-II at different temperatures and calcium concentrations. Our results demonstrate that in the presence of Ca2+ and 4 °C, CrMCA-II undergoes immediate autoprocessing which yields two fragments. With longer incubation times and higher temperatures, there is an increase in cleavage rate, which finally leads to a complete degradation of the protein.
Sekundarne ključne besede:	cysteine proteases;metacaspases;Chlamydomonas reinhardtii;CrMCA-I;CrMCA-II;Cisteinske proteinaze;Univerzitetna in visokošolska dela;
Vrsta dela (COBISS):	Magistrsko delo/naloga
Študijski program:	1000377
Konec prepovedi (OpenAIRE):	1970-01-01
Komentar na gradivo:	Univ. v Ljubljani, Fak. za kemijo in kemijsko tehnologijo, smer Biokemija
Strani:	89 str.
ID:	16306521