doktorska disertacija
Eneko Madorran (Avtor), Uroš Maver (Mentor), Andraž Stožer (Komentor)

Povzetek

Despite there being a substantial range of available drugs on the market, many patients still lack effective and safe medications for their specific conditions, showing a constant need to develop new ones. Toxicological models enable us to assess their safety to various degrees, but all such models have certain limitations. Considering the advantages and drawbacks of these models, we have developed a novel viability method, Membrane Potential Cell Viability Assay (MPCVA), and a novel cell-based in vitro liver model to overcome some of the limitations of these models. The MPCVA evaluates the changes in the membrane potential, so we tested the membrane potential and cell viability relation with a cell-by-cell analysis. The MPCVA was further tested in case of cell exposure to various toxic agents that induce different cell death pathways. Finally, we used MPCVA to determine the viability of our novel cell-based in vitro liver model, which we built by combining four different types of liver cells (hepatocytes, hepatic stellate cells, Kupffer cells, and liver sinusoidal endothelial cells). Along with the MPCVA, we used clinical instrumentation to test the toxicity of three hepatotoxic drugs (5-fluorouracil, ibuprofen, and rifampicin). We observed that, under the given conditions, the MPCVA had a similar toxicity assessment as standard viability methods. We also observed that the toxicity assessment of hepatotoxic drugs is similar to the in vivo toxicity evaluation (clinical data). Therefore, the suggested approach can potentially improve existing toxicological models. However, we understand its translation to clinical practice warrants further experimentation in exposures to other drugs/toxins and by also using other cell types.

Ključne besede

toxicological model;translational analysis;liver in vitro model;cell viability;

Podatki

Jezik: Angleški jezik
Leto izida:
Tipologija: 2.08 - Doktorska disertacija
Organizacija: UM MF - Medicinska fakulteta
Založnik: E. J. Madorran Esteiro]
UDK: 576.3/7.089:612.35:615.9(043.3)
COBISS: 186523395 Povezava se bo odprla v novem oknu
Št. ogledov: 13
Št. prenosov: 0
Ocena: 0 (0 glasov)
Metapodatki: JSON JSON-RDF JSON-LD TURTLE N-TRIPLES XML RDFA MICRODATA DC-XML DC-RDF RDF

Ostali podatki

Sekundarni jezik: Slovenski jezik
Sekundarni naslov: Novel in vitro model for toxicological analysis of drugs
Sekundarni povzetek: Kljub veliki razpoložljivosti različnih zdravilnih učinkovin, veliko bolnikom še vedno primanjkuje učinkovitih in varnih rešitev za zdravljenje njihovih specifičnih bolezni. Slednje kaže na kontinuirano potrebno po razvoju novih zdravil.Kljub relativno velikemu številu razpoložljivih modelov, se njihova uporabna vrednost razlikuje od primera do primera, pri čemer noben ni idealen za vse. V doktorski disertaciji smo se osredotočili na razvoj nove metodo za določanje viabilnosti (imenovane »Test viabilnosti celičnega membranskega potenciala«, angl. Membrane potential cell viability assay«, MPCVA) in novega in vitro modela jeter, s katerimi smo želeli nasloviti nekatere ključne pomanjkljivosti razpoložljivih toksikoloških modelov. Ker se večina obstoječih metod opira na posredno določanje celične smrti (metabolizem, molekularni transport in uhajanje, če jih naštejemo le nekaj), smo razvili novo metodo za neposredno merjenje celične smrti preko merjenja spremembe v membranskem potencialu. Metodo smo testirali na dveh vrstah celic: krvni makrofagi (TLT-celice) in epitelijske rakaste celice dojke (MCF7). Jetrni model in vitro smo pripravili s kombinacijo štirih glavnih vrst jetrnih celic: hepatociti, jetrnimi stelatnimi celicami (HSC), Kupfferjevimi celicami in jetrnimi sinusoidnimi endotelijskimi celicami (LSEC). Uporabljali smo različne kombinacije osnovnih značilnosti modela (sestava in prostornina celičnega gojišča, delež celic in dodajanje zunajceličnega matriksa), da smo določili najprimernejšo kombinacijo lastnosti za posnemanje reprezentativnega in vivo okolja za delovanje jetrnega modela in vitro. Med vsemi kombinacijami smo izbrali konfiguracijo, ki je najbolj natančno posnemala anatomske in fiziološke razmere in vivo. Za validacijo metode MPCVA smo določali korelacijo med membranskim potencialom in viabilnostjo celic v posameznih celicah. V nadzorovanih preskusnih pogojih je metoda MPCVA pokazala dobro natančnost ocene toksičnosti pri primerjavi z uveljavljenimi metodami. Opazili smo tudi različne trende pri merjenju rezultatov, odvisno od celične smrti, kar je dober pokazatelj uporabnost metode v različnih eksperimentalnih scenarijih. Sestava in prostornina celičnega gojišča sta imeli signifikanten vpliv na morfologijo in fiziologijo novega modela jeter in vitro. Izbrana konfiguracija modela je imela primerljive morfološke in fiziološke parametre z razpoložljivimi kliničnimi podatki, ko smo dodali hepatotoksične zdravilne učinkovine. Ob dodatku zdravilnih učinkovin nismo opazili bistvenega toksičnega odgovora pri hepatocitih, medtem ko so bile Kupferjeve in jetrne sinusoidne endotelijske celice (angl. liver sinusoidal endothelial cells, LSEC) najobčutljivejše. Preko uporabljenih analiznih metod se je metoda MPCVA pokazala kot primerljiva z obstoječimi metodami za merjenje celične smrti in ima posledično velik potencial za nadaljnjo uporabo in to tudi v okoliščinah, ko druge metode odpovejo. Slednje še posebej velja, saj ima zaradi neposrednega merjenja metoda MPCVA manjšo verjetnost, da bo prišlo do neustreznega odziva. S tem se zmanjšuje možnost zajema lažnih pozitivnih odzivov, saj metoda ni odvisna od drugih posrednih mehanizmov, ki potekajo v celicah (npr. spremembe v metabolizmu, spremembe v sintezi encimov, spremembe v prehodnosti membrane, itd.). Nov model in vitro je imel primerljive fiziološke odzive in morfološke lastnosti kot klinične podatke. To je pokazatelj, da nov model lahko primerno simulira ključne lastnosti in vivo okolja, s čemer je primeren za določanje toksičnosti zdravil v podobnih okoliščinah kot smo jih uporabili v nalogi. Kljub širokemu naboru uporabljenih metod in poskusov v nalogi, se zavedamo, da bo potrebno izvesti nadaljnje študije z dodatnimi zdravilni učinkovinami, da bi ugotovili splošni potencial razvitega modela jeter in vitro kot integriranega pristopa za testiranje in ocenjevanje (angl. integrated assessment and testing aproach, IATA).
Sekundarne ključne besede: toksikološki modeli;translacijska analiza;model jeter in vitro;viabilnost celic;membranski potencial;
Vrsta dela (COBISS): Doktorska disertacija
Komentar na gradivo: Univ. v Mariboru, Medicinska fak.
Strani: XIII, 129 str.
ID: 17152248