diplomsko delo
Pia Špehar (Avtor), Vera Župunski (Mentor)

Povzetek

Amiotrofična lateralna skleroza (ALS) je progresivna nevrodegenerativna bolezen, ki prizadene motorične nevrone centralnega živčnega sistema. Bolezen so do sedaj povezali z mutacijami več kot 50 genov, izmed katerih je najbolj pogosta mutacija na genu C9ORF72 (odprt bralni okvir 72 kromosoma 9). Ta mutacija povzroči povečanje števila ponovitev GGGGCC (G$_4$C$_2$) v prvem intronu gena, kar vodi v tvorbo netopnih skupkov RNA prepisov teh ponovitev v jedru (angl. RNA foci), sekvestracijo RNA-vezavnih proteinov in sintezo proteinov z dipeptidnimi ponovitvami (DPR). V okviru diplomskega dela smo želeli pripraviti reporterski sistem, s pomočjo katerega bi lahko detektirali smerne in protismerne ponovitve GGGGCC v človeških celičnih kulturah. Če bi v celici zaznali fluorescenco, bi to pomenilo, da so v celici prisotne ponovitve oziroma njihovi prepisi RNA. Uporabili smo vektor pGint, v katerega smo želeli vnesti različno število smernih in protismernih ponovitev in tako ustvariti naš reporterski sistem. Najprej smo v vektor pGint z mestno-specifično mutagenezo vnesli prepoznavno mesto za restriktazo HindIII, nato namnožili vektorje, ki so vsebovali zapis za ponovitve 8×G$_4$C$_2$, 24×G$_4$C$_2$, 48×G$_4$C$_2$, 8×C$_4$G$_2$, 24×C$_4$G$_2$ in 32×C$_4$G$_2$, in iz njih te ponovitve izrezali. Ponovitve smo nato preko restrikcijskih mest za restriktazi BamHI in HindIII vnesli v mutiran pGint. Kljub težavam pri izolaciji ponovitev, nam je uspelo pripraviti pGint, ki je v intronski regiji znotraj zapisa za EGFP vseboval smerne oziroma protismerne heksanukleotidne ponovitve.

Ključne besede

vektor pGint;smerne in protismerne ponovitve GGGGCC;reporterski sistem;diplomska dela;

Podatki

Jezik: Slovenski jezik
Leto izida:
Tipologija: 2.11 - Diplomsko delo
Organizacija: UL FKKT - Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo
Založnik: [P. Špehar]
UDK: 577.21(043.2)
COBISS: 203408131 Povezava se bo odprla v novem oknu
Št. ogledov: 55
Št. prenosov: 9
Ocena: 0 (0 glasov)
Metapodatki: JSON JSON-RDF JSON-LD TURTLE N-TRIPLES XML RDFA MICRODATA DC-XML DC-RDF RDF

Ostali podatki

Sekundarni jezik: Angleški jezik
Sekundarni naslov: Cloning of sense and antisense GGGGCC repeats into the pGINT vector
Sekundarni povzetek: Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a progressive neurodegenerative disease that affects the motor neurons of the central nervous system. So far, the disease has been associated with mutations of more than 50 genes, of which the most common mutation is in the C9ORF72 gene (chromosome 9 open reading frame 72). The mutation causes an expansion of GGGGCC (G$_4$C$_2$) repeats in the first intron of the gene, which leads to formation of insoluble RNA foci in the cell nucleus, sequestration of RNA-binding proteins and synthesis of dipeptide repeat proteins (DPR). As part of our research work, we wanted to prepare a reporter system which would help us detect sense and antisense GGGGCC repeats in human cell cultures. If fluorescence were detected in the cell, it would mean that repeats or their RNA transcripts are present in the cell. We used the vector pGint, in which we wanted to insert a different number of sense and antisense GGGGCC repeats and thus create our reporter system. First, we inserted a restriction site for the restriction enzyme HindIII into the pGint vector by site-specific mutagenesis. We then amplified the vectors containing the 8×G$_4$C$_2$, 24×G$_4$C$_2$, 48×G$_4$C$_2$, 8×C$_4$G$_2$, 24×C$_4$G$_2$ and 32×C$_4$G$_2$ repeats and excised the repeats from them. We then tried to insert the repeats into the mutated pGint through the restriction sites for restriction enzymes BamHI and HindIII. Despite difficulties in isolating the repeats from the vector we managed to prepare the pGint vector, which contained sense and antisense hexanucleotide repeats in the intron within the EGFP open reading frame.
Sekundarne ključne besede: amyotrophic lateral sclerosis;pGint vector;sense and antisense GGGGCC repeats;reporter system;Molekularno kloniranje;Amiotrofična lateralna skleroza;Univerzitetna in visokošolska dela;
Vrsta dela (COBISS): Diplomsko delo/naloga
Študijski program: 1000371
Konec prepovedi (OpenAIRE): 1970-01-01
Komentar na gradivo: Univ. v Ljubljani, Fak. za kemijo in kemijsko tehnologijo, UNI Biokemija
Strani: 1 spletni vir (1 datoteka PDF (37 str.))
ID: 24518591