doktorska disertacija
Alen Pšeničnik (Avtor), Hrvoje Petković (Mentor)

Povzetek

Namen doktorske naloge je razvoj novih metod za detekcijo in povečanje koncentracije heterolognih zunajceličnih proteinov pri bakteriji S. rimosus oz. preizkusiti več različnih pristopov ter ovrednotiti njihovo uporabnost. V začetnem delu smo poenostavili dosedanje načine detekcije zunajceličnih proteinov z uporabo različnih fluorescentnih proteinov. Z analizo ekso-proteoma smo pridobili nove informacije o najbolj zastopanih zunajceličnih proteinih, te informacije smo nato uporabili pri dizajnu ekspresijskih kaset. Z dodatkom poročevalskega sistema smo optimizirali molekularno orodje CRISPR-Cas9 in sam postopek izvajanja delecij s tem orodjem v bakteriji S. rimosus. Razvit sistem Cas9_SD_GusA je uporaben tudi pri inženiringu drugih bakterij, kjer CRISPR orodje ne deluje dobro. Zasnovali in testirali smo tudi sistem usmerjene evolucije na osnovi eritromicinske esteraze EreB, ki omogoča povečevanje količine tarčnega proteina. Z optimiziranim sistemom CRISPR smo izvedli delecije večjih odsekov genoma S. rimosus, in ustvarili metabolno očiščen sev S. rimosus ATCC Δotc Δ145kb, ki ne proizvaja nobenega od glavnih metabolitov te bakterije (rimocidini, oksitetraciklin) in je zato teoretično bolj primeren za industrijsko proizvodnjo heterolognih proteinov in drugih produktov. V konstruiranem sevu smo nato testirali delovanje verzij fuzijskega proteina mCherry-kaminizin in ovrednotili delovanje tega poročevalskega sistema za proizvodnjo industrijsko relevantne proteaze Kaminizin. Rezultati opravljenega dela kažejo prednosti in omejitve vsakega izmed testiranih pristopov ter ustvarjajo podlago za nadaljnji razvoja gostiteljskega organizma S. rimosus za produkcijo heterolognih proteinov in drugih produktov.

Ključne besede

Streptomyces rimosus;heterologni proteini;CRISPR-Cas;molekularna orodja;redukcija genoma;oksitetraciklin;eksoproteom;bioinformacijska analiza;usmerjena evolucija;fluorescentni proteini;

Podatki

Jezik: Slovenski jezik
Leto izida:
Tipologija: 2.08 - Doktorska disertacija
Organizacija: UL BF - Biotehniška fakulteta
Založnik: [A. Pšeničnik]
UDK: 602.3:579.873.7:601.4:577.21(043.3)
COBISS: 218967811 Povezava se bo odprla v novem oknu
Št. ogledov: 17
Št. prenosov: 0
Ocena: 0 (0 glasov)
Metapodatki: JSON JSON-RDF JSON-LD TURTLE N-TRIPLES XML RDFA MICRODATA DC-XML DC-RDF RDF

Ostali podatki

Sekundarni jezik: Angleški jezik
Sekundarni naslov: Development of methods to increase the yield of extracellular heterologous proteins expressed in Streptomyces rimosus
Sekundarni povzetek: The aim of the doctoral thesis was to develop new methods for the detection and increase of the concentration of heterologous extracellular proteins in the bacterium Streptomyces rimosus, and to test several different approaches and evaluate their usefulness. In the initial part, we simplified the existing methods of detecting extracellular proteins by using various fluorescent proteins. Through exoproteome analysis, we obtained new information about the most abundant extracellular proteins, which we then used in the design of expression cassettes. By adding a reporter system, we optimized the CRISPR-Cas9 molecular tool and the procedure for performing deletions with this tool in the bacterium S. rimosus. The developed Cas9_SD_GusA system is also useful for engineering other bacteria where the CRISPR tool does not work well. We also designed and tested a directed evolution system based on erythromycin esterase EreB, which enables the increase of the target protein amount. With the optimized CRISPR system, we performed deletions of larger genome segments of S. rimosus and created a metabolically purified strain of S. rimosus ATCC Δotc Δ145kb, which does not produce any of the main metabolites of this bacterium (rimocidins, oxytetracycline) and is therefore theoretically more suitable for the industrial production of heterologous proteins and other products. In the constructed strain, we then tested the functionality of versions of the fusion protein mCherry-kaminizin and evaluated the performance of this reporter system for the production of the industrially relevant protease Kaminizin. The results of the work performed demonstrate the advantages and limitations of each of the tested approaches and provide a basis for further development of the host organism S. rimosus for the production of heterologous proteins and other products.
Sekundarne ključne besede: Streptomyces rimosus;heterologous proteins;CRISPR-Cas;molecular tools;genome reduction;oxytetracycline;exoproteome;bioinformatic analysis;directed evolution;fluorescent proteins;
Vrsta dela (COBISS): Doktorsko delo/naloga
Študijski program: 0
Konec prepovedi (OpenAIRE): 2025-12-09
Komentar na gradivo: Univ. v Ljubljani, Biotehniška fak.
Strani: 1 spletni vir (1 datoteka PDF (XV, 111 str.)
ID: 25496996