magistrsko delo
Rebeka Dajčman (Avtor), Marko Dolinar (Mentor), Gregor Gunčar (Član komisije za zagovor), Vera Župunski (Član komisije za zagovor)

Povzetek

Sinteznobiološki senzor je naprava, ki izkorišča biološke elemente ter jih sestavlja v biološka vezja, ki ustvarjajo merljiv signal ob prisotnosti tarčnega signala iz okolja. Prisotnost antibiotika vankomicina v naravi lahko pripelje do razvoja odpornosti proti temu antibiotiku, zato je okoljski monitoring ključnega pomena za preprečevanja tega pojava. Dvokomponentni sistem VanRS je regulatorni sistem pri na vankomicin odpornih bakterijah, ki v okolju prepozna signal vankomicin z receptorsko histidin kinazo VanS. Ta aktivira transkripcijski regulator VanR, ki rekrutira RNA-polimerazo na tarčni promotor ter s tem sproži transkripcijo genov za odpornost proti vankomicinu. V odsotnosti signala deluje receptor VanS kot fosfataza. V magistrskem delu smo želeli dvokomponentni sistem, ki ga najdemo pri po Gramu pozitivnih bakterijah, prenesti v po Gramu negativno bakterijo E. coli. Ker vankomicin praviloma ne prehaja skozi zunanjo membrano te bakterije, smo za šasijo izbrali poseben sev E. coli GKCW104, ki v prisotnosti arabinoze tvori pore na zunanji membrani ter tako omogoči vankomicinu vstop v periplazmo. S testom viabilnosti smo določili maksimalno koncentracijo vankomicina v gojišču 0,1 μg/mL, ki ne vpliva na preživetje izbranih celic v razponu osmih ur. Po priporočilih sinteznobiološkega standarda RFC 10 smo pripravili vektor z zapisom za zeleni fluorescenčni protein pod inducibilnim promotorjem PvanY. Zapisa za VanRm in VanS smo pridobili iz bakterije Enterococcus faecalis z verižno reakcijo s polimerazo in ju nato pod konstitutivnim promotorjem vstavili v biološko vezje, ki je že vsebovalo reporterski del. Z vektorjem, ki je nosil komponente biosenzorskega vezja, smo uspešno transformirali bakterijo E. coli GKCW104. Nato smo na njej določili koncentracijsko odvisnost signala ter preverili pojav nespecifične fluorescence s kontrolami.Pojav nespecifične fluorescence, ki ni bil odvisen od prisotnosti vankomicina, smo opazili pri vzorcih z nepopolnim biosenzorskim vezjem. Intenziteta je bila celo višja kot v vzorcih s popolnim vezjem. Pri preučevanju odziva biosenzorskih celic s popolnim vezjem na različne koncentracije vankomicina, intenzitete fluorescence niso naraščale s koncentracijo vankomicina, iz česar smo zaključili, da pripravljeni biosenzor ni zmožen reagirati na vankomicin v izbranem koncentracijskem območju.

Ključne besede

VanRS;antibiotiki;vankomicin;odpornost proti antibiotikom;E. coli;magistrska dela;

Podatki

Jezik: Slovenski jezik
Leto izida:
Tipologija: 2.09 - Magistrsko delo
Organizacija: UL FKKT - Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo
Založnik: [R. Dajčman]
UDK: 577.2(043.2)
COBISS: 243049731 Povezava se bo odprla v novem oknu
Št. ogledov: 109
Št. prenosov: 24
Ocena: 0 (0 glasov)
Metapodatki: JSON JSON-RDF JSON-LD TURTLE N-TRIPLES XML RDFA MICRODATA DC-XML DC-RDF RDF

Ostali podatki

Sekundarni jezik: Angleški jezik
Sekundarni naslov: Construction of a cell-based synthetic biological system for the detection of vancomycin in bacterium Escherichia coli
Sekundarni povzetek: A synthetic biological sensor utilizes biological elements and assembles them into biological circuits, which generate a measurable signal in the presence of a target environmental input. The presence of vancomycin in nature can lead to the development of resistance, making environmental monitoring crucial for preventing this phenomenon. The two-component VanRS system is a regulatory system of vancomycin-resistant bacteria that recognizes the vancomycin signal in the environment via the receptor histidine kinase VanS. VanS activates the transcriptional regulator VanR, which recruits RNA-polymerase to the target promoter and thus initiates the transcription of genes for vancomycin resistance. In the absence of signal the receptor VanS acts as phosphatase. In the master's thesis, we wanted to transfer the two-component VanRS system into the Gram-negative E. coli. Since vancomycin does not cross the outer membraneof these bacteria, we use the E. coli strain GKCW104 as the chassis, which is capable of synthesizing pores on the outer membrane in the presence of arabinose, thus enabling vancomycin to enter the periplasm. Using the viability test, we determined the maximum concentration of vancomycin (0,1 μg/mL) that does not affect cell survival over an eight-hour period. Following the RFC 10 recommendations of the synthetic biology standard RFC 10, we prepared a vector encoding green fluorescent protein (GFP) under the inducible promoter PvanY. The nucleotide sequences vanR and vanS were first obtained from the bacterium E. faecalis using polymerase chain reaction and than inserted under constitutive promotor into a biological circuit with the reporter part already contained. We successfully transformed E. coli GKCW104 with a vector carrying the biosensor components and determined concentration dependence of the signal on final biosensor and the occurrence of non-specific fluorescence on an incomplete biosensor.The appearance of non-specific fluorescence, which was not dependent on the presence of vancomycin, was observed in samples with an incomplete biosensor circuit. The intensity was even higher than in samples with a complete circuit. When studying the response of biosensor cells to different concentrations of vancomycin, the fluorescence intensities did not increase with the concentration of vancomycin, from which we concluded that the prepared biosensor is not capable of reacting to vancomycin in the selected concentration range.
Sekundarne ključne besede: VanRS;biosensor;vancomycin;E. coli;Biosenzorji;Univerzitetna in visokošolska dela;
Vrsta dela (COBISS): Magistrsko delo/naloga
Študijski program: 1000377
Komentar na gradivo: Univ. v Ljubljani, Fak. za kemijo in kemijsko tehnologijo, smer Biokemija
Strani: 1 spletni vir (1 datoteka PDF (95 str.))
ID: 26712313