diplomsko delo
Primož Šenica Pavletič (Avtor), Sergej Pirkmajer (Mentor)

Povzetek

Skeletnomišične celice energije za svoje delovanje pridobivajo prek mitohondrijske oksidativne fosforilacije in glikolize. Laktat je glavni produkt glikolize in hkrati potencialni vir energije. V diplomski nalogi smo na podganjih mišičnih celicah linije L6 preučevali, katera presnovna pot prevladuje pri sintezi ATP. Prav tako nas je zanimalo, ali povečana aktivnost Na$^+$/K$^+$-ATPaze, ene največjih porabnic ATP, sproži preklop v smer glikolize in poveča nastajanje laktata. Za določitev presnovnega fenotipa celic L6 smo analizirali izraženost laktatnih prenašalcev MCT1, MCT2 in MCT4 ter z napravo Seahorse Agilent testirali, kateri inhibitor MCT-prenašalcev je najučinkovitejši. S pomočjo naprave smo tudi kvantificirali delež proizvedenega ATP prek oksidativne fosforilacije in glikolize. Seahorse Agilent smo uporabili ob dodatku specifičnih presnovnih zaviralcev (2-DG, GNE-140, MON, OM) ter zaviralca MCT1 (AZD) in s tem preučevali energetskega metabolizma celic (meritve ECAR in OCR). Z monenzinom smo stimulirali Na$^+$/K$^+$-ATPazo, da bi posnemali povečano porabo ATP. Ekspresijski profil laktatnih prenašalcev (prevladujoč MCT1, nizka raven MCT4 in zanemarljivo nizka raven MCT2) kaže na oksidativen presnovni fenotip celic L6, kar pokažejo tudi rezultati analize Seahorse – v teh celicah večina ATP nastaja prek oksidativne fosforilacije. LDH test je pokazal, da GNE-140 že v nizkih koncentracijah učinkovito zavira pretvorbo piruvata v laktat, učinkoviteje kot OXA. To smo dodatno potrdili tudi z uporabo naprave Seahorse Agilent. Zaviranje glikolize z 2-DG, zaviranje LDH z GNE-140 in zaviranje prenosa laktata z zaviralcem MCT1 (AZD) je povzročilo izrazit padec ECAR, medtem ko je OCR ostal skoraj nespremenjen. Po dodatku MON se je ECAR izrazito povišal le ob prisotnosti AZD. Pri 2-DG in GNE-140 je bilo povišanje le rahlo, kar nakazuje, da glikoliza pomembno prispeva k zagotavljanju ATP za delovanje Na$^+$/K$^+$-ATPaze. Zaviranje oksidativne fosforilacije z OM je močno zmanjšalo OCR, medtem ko je aktivacija Na$^+$/K$^+$-ATPaze z MON povečala ECAR. Iz tega sklepamo, da se celice L6 ob povečani potrebi po energiji preusmerijo na glikolizo, kadar oksidativna pot ne zadošča. To odraža njihovo presnovno prilagodljivost.

Ključne besede

ATPaza;stopnja zunajcelične zakisanosti;ECAR;stopnja porabe kisika;OCR;monokarboksilatni prenabalec;MCT;celi na linija iz podganjih skeletnih mibic;L6;diplomska dela;

Podatki

Jezik: Slovenski jezik
Leto izida:
Tipologija: 2.11 - Diplomsko delo
Organizacija: UL FKKT - Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo
Založnik: [P. Šenica Pavletič]
UDK: 612.744(043.2)
COBISS: 254700803 Povezava se bo odprla v novem oknu
Št. ogledov: 97
Št. prenosov: 10
Ocena: 0 (0 glasov)
Metapodatki: JSON JSON-RDF JSON-LD TURTLE N-TRIPLES XML RDFA MICRODATA DC-XML DC-RDF RDF

Ostali podatki

Sekundarni jezik: Angleški jezik
Sekundarni naslov: The influence of Na$^+$/K$^+$ pump activity on lactate production in skeletal muscle cells in vitro
Sekundarni povzetek: Skeletal muscle cells generate energy for their functioning primarily through mitochondrial oxidative phosphorylation and glycolysis. Lactate, the main product of glycolysis, also serves as a potential energy substrate. In this thesis, we investigated which metabolic pathway predominates in ATP synthesis in rat skeletal muscle L6 cells. We further examined whether enhanced activity of the Na$^+$/K$^+$-ATPase—one of the largest cellular ATP consumers—induces a metabolic shift toward glycolysis and promotes lactate production. To characterize the metabolic phenotype of L6 cells, we analyzed the expression of lactate transporters (MCT1, MCT2, and MCT4) and employed the Seahorse Agilent analyzer to determine the effectiveness of different MCT inhibitors. The device was also used to quantify the contributions of oxidative phosphorylation and glycolysis to ATP production, both under basal conditions and in the presence of specific metabolic inhibitors (2-DG, GNE-140, MON, OM) as well as the MCT1 inhibitor AZD. Stimulation of the Na$^+$/K$^+$-ATPase was achieved with monensin to mimic increased ATP consumption. The expression profile of lactate transporters—predominantly MCT1, with low levels of MCT4 and negligible MCT2—suggested an oxidative metabolic phenotype, which was consistent with Seahorse measurements showing that most ATP in L6 cells is produced via oxidative phosphorylation. The LDH assay demonstrated that GNE-140 effectively inhibited the conversion of pyruvate to lactate at low concentrations, more strongly than OXA, a result further supported by Seahorse analysis. Inhibition of glycolysis (2-DG), LDH (GNE-140), and lactate transport (AZD) markedly reduced ECAR, while OCR remained largely unchanged. Upon monensin addition, ECAR increased significantly only in the presence of AZD; with 2-DG or GNE-140, the increase was modest, indicating that glycolysis plays an important role in fueling the Na$^+$/K$^+$-ATPase. In contrast, inhibition of oxidative phosphorylation with OM strongly reduced OCR, while Na$^+$/K$^+$-ATPase activation elevated ECAR. Taken together, these findings show that L6 cells rely mainly on oxidative phosphorylation under basal conditions but can shift toward glycolysis when energy demand increases, reflecting their metabolic flexibility.
Sekundarne ključne besede: ATPaze;ECAR;OCR;MCT;L6;Progaste mišice;Adenozin trifosfat;Univerzitetna in visokošolska dela;
Vrsta dela (COBISS): Diplomsko delo/naloga
Študijski program: 1000371
Konec prepovedi (OpenAIRE): 1970-01-01
Komentar na gradivo: Univ. v Ljubljani, Fak. za kemijo in kemijsko tehnologijo, UNI Biokemija
Strani: 1 spletni vir (1 datoteka PDF (49 str.))
ID: 27250036