magistrsko delo
Povzetek
Genska elektrotransfekcija je ena izmed glavnih nevirusnih metod za dostavo plazmidne DNK
v notranjost bioloških celic. Ta metoda temelji na pojavu elektroporacije, pri katerem se ob
izpostavitvi celic pulzirajočemu električnemu polju začasno poveča prepustnost celičnih
membran, kar pa omogoča vnos terapevtskih molekul v celice. Uporaba naprav z
nanostrukturiranimi geometrijami, kot so nanoslamice, nanokanali in nanopore, omogoča
lokalizacijo električnega polja na majhnih delih celične membrane, s čimer je mogoče znatno
povečati učinkovitost genske elektrotransfekcije in izboljšati preživetje celic. Slabosti takšnih
nanostrukturiranih naprav so, da niso splošno dostopne in zahtevajo strokovno znanje
postopkov nanofabrikacije ter dostop do čistih prostorov. Nedavno pa je bilo dokazano, da je
mogoče doseči zelo učinkovito elektrotransfekcijo plazmidov tudi z uporabo komercialnih
polikarbonatnih membran z nanoporami polmera 0,05 μm. Zato v tej raziskovalni nalogi
preučujem in želim oblikovati pristop elektrotransfekcije, ki temelji na komercialno dostopnih
vstavkih s poroznimi membranami iz polietilentereftalata (PET), namenjenim za kulturo in
preučevanje biologije celic. Najprej z numeričnim modeliranjem na ravni ene celice določim
parametre električnega pulza, velikost por porozne membrane in druge dejavnike, za katere se
pričakuje, da bodo povzročili znotrajcelično dostavo plazmidov. Na podlagi numeričnih
rezultatov oblikujem preprosto napravo, ki vsebuje vstavek, porozno membrano s porami
polmera 0,2 m, 0,5 m ali 1,5 m, večjamično ploščo in par žičnih elektrod. Napravo nato
tudi numerično modeliram, da načrtam ustrezno postavitev in konfiguracijo elektrod, ki
omogoči homogeno porazdelitev električne napetosti vzdolž porozne membrane. Napravo nato
preizkusim na treh celičnih linijah sesalcev in ovrednotim učinkovitost genske transfekcije ter
preživetje celic. Pridobljeni rezultati so primerljivi z rezultati klasične genske
elektrotransfekcije, pri kateri suspenzijo celic ali celice, pritrjene na podlago, postavimo med
par vzporednih elektrod in jih izpostavimo homogenemu električnemu polju. Vendar uporaba
poroznih vstavkov omogoča dovajanje nizkonapetostnih pulzov, ki ne zahtevajo uporabe dragih
visokonapetostnih elektroporatorjev in je možno pulzni generator izdelati tudi doma. Na koncu
diskutiram še o možnostih nadaljnjih raziskav, vezanih na vpliv lastnosti porozne membrane,
kot so debelina, poroznost in polmer por, na učinkovitost transfekcije.
Ključne besede
genska elektrotransfekcija;elektroporacija;transfekcija;porozna membrana;lokalizirana elektroporacija;numerično modeliranje;ovarijske celice kitajskega hrčka (CHO);mioblasti;celična linija C2C12;celična linija H9C2;magisteriji;
Podatki
Jezik: |
Slovenski jezik |
Leto izida: |
2022 |
Tipologija: |
2.09 - Magistrsko delo |
Organizacija: |
UL FE - Fakulteta za elektrotehniko |
Založnik: |
[T. Vindiš] |
UDK: |
602.621(043.3) |
COBISS: |
120770051
|
Št. ogledov: |
32 |
Št. prenosov: |
12 |
Ocena: |
0 (0 glasov) |
Metapodatki: |
|
Ostali podatki
Sekundarni jezik: |
Angleški jezik |
Sekundarni naslov: |
Gene electrotransfer using porous membranes |
Sekundarni povzetek: |
Gene electrotransfer is one of the main non-viral methods for intracellular delivery of plasmid
DNA, wherein exposure of biological cells to pulsed electric field induces electroporation, that
is a transient increase in cell membrane permebility to exogenous molecules. By localizing the
electric field on small parts of the cell membrane using nanostructured geometries such as
nanostraws, nanochannels, and nanopores, the efficiency of gene electrotransfer and cell
viability can be significantly increased. Disadvantages of such nanofabricated devices are that
they are not widely available and require nanofabrication expertise and access to cleanroom. It
has recently been shown that highly efficient electrotransfer of plasmids can also be achieved
using commercial polycarbonate membranes with nanopores of 0.05 μm in radius. Therefore,
in this thesis I study and design an electrotransfer approach based on commercially available
cell culture inserts with porous membrane from polyethylene terephthalate (PET). First, I use
numerical modeling at the single cell level to determine electric pulse parameters, size of pores
in the porous membrane, and other factors expected to result in successful gene electrotransfer.
Based on the numerical results, I design a simple device that contains an insert with porous
membrane containing pores with radius of 0,2 µm, 0,5 µm or 1,5 µm, a multiwell plate, and a
pair of wire electrodes. I numerically model the device to improve the placement and
configuration of the electrodes, in order to achieve a homogenous voltage along the entire
porous membrane. I then test the device using three mammalian cell lines and assess the
transfection efficiency and cell viability. The results are comparable to those obtained in
previous studies using classical gene electrotransfer, where cells in suspension or adhered to
surface are placed between a pair of parallel electrodes and exposed to homogenous electric
field. However, the porous membranes enable application of low-voltage pulses, which do not
require the use of expensive high-voltage electroporators. Finally, I discuss further research
directions to assess the influence of porous membrane properties, such as thickness, porosity,
and pore radius on transfection efficiency and cell viability. |
Sekundarne ključne besede: |
Gene electrotransfer;electroporation;transfection;cell culture insert;localized electroporation;numerical modeling;Chinese hamster ovary cells (CHO);myoblasts;C2C12 cell line;H9C2 cell line; |
Vrsta dela (COBISS): |
Magistrsko delo/naloga |
Študijski program: |
1000316 |
Konec prepovedi (OpenAIRE): |
1970-01-01 |
Komentar na gradivo: |
Univ. v Ljubljani, Fak. za elektrotehniko |
Strani: |
XII, 82 f. |
ID: |
16391558 |